ניתוח האינטראקציה של חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית עם מיקרו-וסיקלים מלאכותיים של פוספוליפידים באמצעות ציטומטריה כמותית של זרימה
Summary
כאן, אנו מתארים קבוצה של שיטות לאפיון האינטראקציה של חלבונים עם ממברנות של תאים או microvesicles.
Abstract
בגוף האדם, רוב התגובות הפיזיולוגיות העיקריות המעורבות בתגובה החיסונית ובקרישת הדם ממשיכות על קרומי התאים. צעד ראשון חשוב בכל תגובה התלויה בממברנה הוא קשירת חלבון על קרום הפוספוליפידים. גישה לחקר אינטראקציה של חלבונים עם ממברנות שומנים פותחה באמצעות חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי וציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות בין חלבונים לממברנה באמצעות תאים חיים ושלפוחיות פוספוליפיד טבעיות או מלאכותיות. היתרון של שיטה זו הוא הפשטות והזמינות של ריאגנטים וציוד. בשיטה זו, חלבונים מסומנים באמצעות צבעים פלואורסצנטיים. עם זאת, ניתן להשתמש הן בחלבונים מתוצרת עצמית והן באופן מסחרי, המסומנים באופן פלואורסצנטי. לאחר הצמדה עם צבע פלואורסצנטי, החלבונים מודגרים עם מקור של קרום פוספוליפידים (microvesicles או תאים), והדגימות מנותחות על ידי ציטומטריה של זרימה. ניתן להשתמש בנתונים המתקבלים כדי לחשב את הקבועים הקינטיים ואת שיווי המשקל Kd. בנוסף, ניתן להעריך את המספר המשוער של אתרי קשירת חלבונים על קרום הפוספוליפידים באמצעות חרוזי כיול מיוחדים.
Introduction
ביוממברנים מפרידים בין התוכן הפנימי של תאי בעלי החיים לבין החלל החוץ-תאי. שימו לב שממברנות מקיפות גם מיקרו-וסיקלים שנוצרו במהלך מחזור החיים של התא ובאברונים. קרום התא מורכב בעיקר מליפידים וחלבונים. חלבוני ממברנה מבצעים תפקודי איתות, מבניים, הובלה ודבקים. עם זאת, דו-שכבת השומנים חיונית גם ליחסי הגומלין של תא החיה עם המרחב החוץ-תאי. מאמר זה מציע שיטה לחקר האינטראקציה ההיקפית של חלבונים חיצוניים עם קרום השומנים.
הדוגמה הבולטת ביותר לתגובות המתרחשות בשכבת הממברנה החיצונית של תא בעל חיים היא תגובת קרישת הדם. תכונה חשובה של קרישת דם היא שכל התגובות העיקריות ממשיכות על ממברנות הפוספוליפידים של תאים ומיקרו-וסיקלים הנובעים מתאים אלה ולא בפלזמה 1,2,3. תגובות תלויות ממברנה כוללות את התהליך של קרישה התחלתית (על קרומי התאים של תת-האנדותל, אנדותל מודלק, או תאי חיסון פעילים, בהשתתפות גורם רקמה), כל התגובות של הפעלת המפל העיקרי של גורמים IX, X, פרותרומבין; הפעלה של גורם XI על ידי טרומבין (על הממברנות של טסיות מופעלות, אריתרוציטים, ליפופרוטאינים ומיקרו-וסיקלים); תגובות של מסלול חלבון C; אי-פעילות של אנזימי קרישה (על הממברנות של תאי האנדותל בהשתתפות קומפקטורים טרומבודולין, קולטן חלבון אנדותל C, הפארן סולפט); ותגובות מסלול מגע (על ממברנות של טסיות דם וכמה מיקרו-סיביות בהשתתפות גורמים משלימים לא ידועים). לכן, אי אפשר לחקור קרישת דם מבלי לחקור את האינטראקציה של חלבוני פלזמה שונים עם קרום תאי הדם.
מאמר זה מתאר שיטה מבוססת זרימה-ציטומטריה לאפיון האינטראקציה של חלבונים עם ממברנות ליפידים של תאים או מיקרו-וסיקלים. גישה זו הוצעה בתחילה כדי לחקור את האינטראקציה של פלזמה בדם עם טסיות דם ושלפוחיות פוספוליפיד מלאכותיות. יתר על כן, רוב החלבונים שנחקרו מתקשרים ישירות עם פוספוליפידים של ממברנה טעונה שלילית, במיוחד עם פוספטידיל-סרין 4,5. בנוסף, ישנם חלבונים שהאינטראקציה שלהם עם הממברנה מתווכת על ידי קולטנים מיוחדים6.
יכולת חשובה של ציטומטריית זרימה היא הבחנה בין ליגנדות חופשיות וכבולות ללא הפרדה נוספת. תכונה זו של ציטומטריה מאפשרת לחקור את קשירת שיווי המשקל של ליגנד בנקודת הקצה ומסייעת בביצוע מדידות קינטיות רציפות. הטכניקה אינה מתוחכמת ואינה דורשת הכנת דגימה מורכבת. ציטומטריית זרימה משמשת באופן פעיל כדי לחקור באופן כמותי את הדינמיקה של אינטראקציה בין פפטידים פלואורסצנטיים, קולטנים וחלבוני G בנויטרופילים שלמים וחדירי דטרגנטים7. גישה זו ישימה גם לחקר אינטראקציות חלבון-דנ”א והקינטיקה של פעילות אנדונוקלאז בזמן אמת8. עם הזמן, שיטה זו שימשה למחקר כמותי של אינטראקציות חלבון-חלבון בעלות זיקה גבוהה עם שלפוחיות שומניםמטוהרות 9, או, באופן כללי יותר, עם חלבוני ממברנה המתבטאים במערכת ביטוי יעילה ביותר של תאי Sf910. שיטות כמותיות תוארו גם לאפיון אינטראקציות חלבון-ליפוזום באמצעות ציטומטריה של זרימה עבור חלבוני טרנס-ממברנה11.
טכניקה זו משתמשת בחרוזי כיול מתוצרת עצמית כדי להימנע משימוש בחרוזים זמינים מסחרית7. חרוזי הכיול ששימשו בעבר7 נועדו לעבוד עם פלואורסציין, מה שהגביל באופן מהותי את מבחר הליגנדות הפלואורסצנטיות הנגישות על החלבונים. בנוסף, מאמר זה מציע דרך חדשה לרכוש ולנתח נתונים קינטיים לרזולוציה סבירה של זמן. למרות ששיטה זו מתוארת עבור שלפוחיות פוספוליפיד מלאכותיות, אין מגבלות ברורות על יכולת ההסתגלות שלה לתאים, בועיות טבעיות או שלפוחיות פוספוליפיד מלאכותיות עם הרכב שומנים שונה. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הערכה של הפרמטרים של אינטראקציה (kon, koff) ושיווי משקל (Kd) ומאפשרת אפיון כמותי של מספר אתרי קשירת החלבונים על הממברנה. שים לב שטכניקה זו מספקת הערכה משוערת של מספר אתרי הקישור. היתרונות של השיטה הם הפשטות היחסית שלה, הנגישות ויכולת ההסתגלות שלה לתאים מקומיים ולמיקרו-ווסיקלים טבעיים ומלאכותיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתן להתאים את השיטה המוצעת לאפיון גס של האינטראקציה של חלבונים עם ממברנות פוספוליפידיות ממקורות והרכבים שונים. הציטומטריה הכמותית של הזרימה המתוארת כאן מוותרת על תהודת פלסמון פני השטח (SPR) במספר פרמטרים. בפרט, יש לו רגישות נמוכה יותר ורזולוציית זמן והוא דורש תיוג פלואורסצנטי של חלבונים. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים נתמכו על ידי מענק של הקרן הרוסית למדע 20-74-00133.
Materials
| A23187 | Sigma Aldrich | C7522-10MG | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific | A37573 | fluorescent dye |
| Apyrase from potatoes | Sigma Aldrich | A2230 | |
| BD FACSCantoII | BD Bioscience | ||
| bovine serum albumin | VWR Life Science AMRESCO | Am-O332-0.1 | |
| Calcium chloride, anhydrous, powder, ≥97% | Sigma Aldrich | C4901-100G | |
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer | Agilent | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528-1KG | |
| DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate) | Thermo Fisher Scientific | D384 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | |
| EDTA disodium salt | VWR Life Science AMRESCO | Am-O105B-0.1 | |
| FACSDiva | BD Bioscience | cytometry data acquisition software | |
| FlowJo | Tree Star | cytometer software for data analysis | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-500G | |
| Human Factor X | Enzyme research | HFX 1010 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Panreac | 141914.1209 | |
| L-α-phosphatidylcholine (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids | 840053P | |
| L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840032P | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M8266-100G | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610020-1EA | |
| OriginPro 8 SR4 v8.0951 | OriginLab Corporation | Statistical software | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade | VWR Life Science AMRESCO | 97062-732 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Prostaglandin E1 | Cayman Chemical | 13010 | |
| Sephadex G25 | GE Healthcare | GE17-0033-01 | gel filtration medium for protein purification |
| Sepharose CL-2B | Sigma Aldrich | CL2B300-500ML | gel filtration medium for platelet purification |
| Sodium bicarbonate | Corning | 61-065-RO | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S3139-250G | |
| Spin collumns with membrane 0.2 µm | Sartorius | VS0171 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804-1KG |
References
- Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of hemostasis. Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).
- Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of thrombin generation. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).
- Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion. Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).
- Podoplelova, N. A., et al. Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).
- Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).
- Kotova, Y., et al. Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin αIIbβ3 and fibrinogen. Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).
- Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).
- Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry. Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).
- Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. Fluorescence analysis of receptor−G protein interactions in cell membranes. Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).
- Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding. Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).
- De Franceschi, N., et al. ProLIF – Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes. Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).
