Floresan Etiketli Proteinlerin Yapay Fosfolipid Mikrovezikülleri ile Etkileşiminin Kantitatif Akış Sitometrisi Kullanılarak Analiz Edilmesi
Summary
Burada, proteinlerin hücre zarları veya mikro-parçacıklarla etkileşimini karakterize etmek için bir dizi yöntem açıklıyoruz.
Abstract
İnsan vücudunda, bağışıklık tepkisi ve kan pıhtılaşmasında rol oynayan başlıca fizyolojik reaksiyonların çoğu, hücrelerin zarları üzerinde ilerler. Herhangi bir membrana bağımlı reaksiyonda önemli bir ilk adım, proteinin fosfolipit membranına bağlanmasıdır. Lipid membranları ile protein etkileşimini incelemek için floresan olarak etiketlenmiş proteinler ve akış sitometrisi kullanılarak bir yaklaşım geliştirilmiştir. Bu yöntem, canlı hücreler ve doğal veya yapay fosfolipid vezikülleri kullanarak protein-membran etkileşimlerinin incelenmesine izin verir. Bu yöntemin avantajı, reaktiflerin ve ekipmanların basitliği ve kullanılabilirliğidir. Bu yöntemde, proteinler floresan boyalar kullanılarak etiketlenir. Bununla birlikte, hem kendi kendine yapılan hem de ticari olarak temin edilebilen, floresan etiketli proteinler kullanılabilir. Bir floresan boya ile konjugasyondan sonra, proteinler bir fosfolipid membran kaynağı (mikro-parçacıklar veya hücreler) ile inkübe edilir ve örnekler akış sitometrisi ile analiz edilir. Elde edilen veriler kinetik sabitleri ve denge Kd’yi hesaplamak için kullanılabilir. Ek olarak, fosfolipit membranındaki protein bağlanma bölgelerinin yaklaşık sayısını özel kalibrasyon boncukları kullanarak tahmin etmek mümkündür.
Introduction
Biyomembranlar, hayvan hücrelerinin iç içeriğini ve hücre dışı alanı ayırır. Membranların ayrıca hücrenin yaşam döngüsü ve organelleri sırasında oluşan mikro-parçacıkları çevrelediğini unutmayın. Hücre zarı ağırlıklı olarak lipitlerden ve proteinlerden oluşur. Membran proteinleri sinyalizasyon, yapısal, taşıma ve yapışkan fonksiyonları yerine getirir. Bununla birlikte, lipit çift katmanı, hayvan hücresinin hücre dışı boşlukla olan ilişkisi için de gereklidir. Bu makale, dış proteinlerin lipit membranı ile periferik etkileşimini incelemek için bir yöntem önermektedir.
Bir hayvan hücresinin dış zar tabakasında meydana gelen reaksiyonların en çarpıcı örneği, kan pıhtılaşma reaksiyonudur. Kan pıhtılaşmasının önemli bir özelliği, tüm ana reaksiyonların plazmada değilhücrelerin fosfolipid membranlarında ve bu hücrelerden kaynaklanan mikro-parçacıklarda ilerlemesidir 1,2,3. Membrana bağımlı reaksiyonlar, pıhtılaşmaya başlama sürecini (subendotelin hücre zarlarında, iltihaplı endotel veya aktive olmuş bağışıklık hücrelerinde, bir doku faktörünün katılımıyla), IX, X, protrombin faktörlerinin ana kaskad aktivasyonunun tüm reaksiyonlarını; faktör XI’nin trombin ile aktivasyonu (aktif trombositlerin, eritrositlerin, lipoproteinlerin ve mikro-parçacıkların zarlarında); protein C yolunun reaksiyonları; pıhtılaşma enzimlerinin inaktivasyonu (trombomodülin kofaktörlerinin, endotel protein C reseptörünün, heparan sülfatın katılımıyla endotel hücrelerinin zarlarında); ve temas yolu reaksiyonları (trombosit zarları ve bilinmeyen kofaktörlerin katılımıyla bazı mikro-parçacıklar üzerinde). Bu nedenle, çeşitli plazma proteinlerinin kan hücrelerinin zarı ile etkileşimini incelemeden kan pıhtılaşmasını araştırmak imkansızdır.
Bu yazıda, proteinlerin hücrelerin veya mikro-parçacıkların lipit membranları ile etkileşimini karakterize etmek için akış sitometrisine dayalı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım başlangıçta kan plazmasının trombositler ve yapay fosfolipid vezikülleri ile etkileşimini incelemek için önerilmiştir. Ayrıca, incelenen proteinlerin çoğu, negatif yüklü membran fosfolipitleriyle, özellikle fosfatidilserin 4,5 ile doğrudan etkileşime girer. Ek olarak, membranla etkileşimi özelreseptörler 6 tarafından aracılık edilen proteinler vardır.
Akış sitometrisinin önemli bir yeteneği, ek bir ayrım olmaksızın serbest ve bağlı ligandlar arasında ayrım yapmaktır. Sitometrinin bu özelliği, son noktada ligand dengesi bağlanmasının incelenmesine izin verir ve sürekli kinetik ölçümlerin yapılmasına yardımcı olur. Teknik karmaşık değildir ve karmaşık numune hazırlama gerektirmez. Akış sitometrisi, bozulmamış ve deterjan geçirgen nötrofillerde floresan peptitler, reseptörler ve G-proteinleri arasındaki etkileşim dinamiklerini kantitatif olarak incelemek için aktif olarak kullanılır7. Bu yaklaşım, protein-DNA etkileşimlerini ve endonükleaz aktivitesinin kinetiğini gerçek zamanlı olarak araştırmak için de geçerlidir8. Zamanla, bu yöntem, saflaştırılmış lipit vezikülleri 9 ile veya daha genel olarak, yüksek verimli birSf9 hücre ekspresyon sistemi10’da eksprese edilen membran proteinleri ile yüksek afiniteli protein-protein etkileşimlerini nicel olarak incelemek için kullanılmıştır. Transmembran proteinleri için akış sitometrisi kullanılarak protein-lipozom etkileşimlerini karakterize etmek için kantitatif yöntemler de tanımlanmıştır11.
Bu teknik, piyasada satılan boncukları kullanmaktan kaçınmak için kendi kendine yapılan kalibrasyon boncuklarını kullanır7. Daha önce7 kullanılan kalibrasyon boncuklarının, proteinler üzerindeki erişilebilir floresan ligandlarının çeşitliliğini önemli ölçüde kısıtlayan floresein ile çalışması amaçlanmıştır. Ek olarak, bu makale makul bir zaman çözünürlüğü için kinetik verileri elde etmek ve analiz etmek için yeni bir yol sunmaktadır. Bu yöntem yapay fosfolipid vezikülleri için tanımlanmış olmasına rağmen, hücrelere, doğal veziküllere veya farklı bir lipit bileşimine sahip yapay fosfolipid veziküllerine adaptasyonu için belirgin bir sınırlama yoktur. Burada açıklanan yöntem, etkileşim (kaçık, kkapalı) ve denge (Kd) parametrelerinin tahmin edilmesine izin verir ve membran üzerindeki protein bağlanma bölgelerinin sayısının kantitatif karakterizasyonunu kolaylaştırır. Bu tekniğin, bağlama bölgelerinin sayısının yaklaşık bir tahminini sağladığını unutmayın. Yöntemin avantajları, göreceli basitliği, erişilebilirliği ve doğal hücrelere ve doğal ve yapay mikro-parçacıklara uyarlanabilirliğidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Önerilen yöntem, proteinlerin çeşitli kaynaklardan ve bileşimlerden fosfolipid membranlarla etkileşiminin kabaca karakterize edilmesi için uyarlanabilir. Burada tarif edilen kantitatif akım sitometrisi, çeşitli parametrelerde yüzey plazmon rezonansını (SPR) kabul eder. Özellikle, daha düşük bir hassasiyete ve zaman çözünürlüğüne sahiptir ve proteinlerin floresan etiketini gerektirir. Floresan etiketleme, birçok protein için konformasyonda bir değişikliğe ve aktivite kaybına neden olabilir ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Rus Bilim Vakfı’nın 20-74-00133 hibesiyle desteklenmiştir.
Materials
| A23187 | Sigma Aldrich | C7522-10MG | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific | A37573 | fluorescent dye |
| Apyrase from potatoes | Sigma Aldrich | A2230 | |
| BD FACSCantoII | BD Bioscience | ||
| bovine serum albumin | VWR Life Science AMRESCO | Am-O332-0.1 | |
| Calcium chloride, anhydrous, powder, ≥97% | Sigma Aldrich | C4901-100G | |
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer | Agilent | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528-1KG | |
| DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate) | Thermo Fisher Scientific | D384 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | |
| EDTA disodium salt | VWR Life Science AMRESCO | Am-O105B-0.1 | |
| FACSDiva | BD Bioscience | cytometry data acquisition software | |
| FlowJo | Tree Star | cytometer software for data analysis | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-500G | |
| Human Factor X | Enzyme research | HFX 1010 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Panreac | 141914.1209 | |
| L-α-phosphatidylcholine (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids | 840053P | |
| L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840032P | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M8266-100G | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610020-1EA | |
| OriginPro 8 SR4 v8.0951 | OriginLab Corporation | Statistical software | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade | VWR Life Science AMRESCO | 97062-732 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Prostaglandin E1 | Cayman Chemical | 13010 | |
| Sephadex G25 | GE Healthcare | GE17-0033-01 | gel filtration medium for protein purification |
| Sepharose CL-2B | Sigma Aldrich | CL2B300-500ML | gel filtration medium for platelet purification |
| Sodium bicarbonate | Corning | 61-065-RO | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S3139-250G | |
| Spin collumns with membrane 0.2 µm | Sartorius | VS0171 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804-1KG |
References
- Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of hemostasis. Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).
- Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of thrombin generation. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).
- Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion. Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).
- Podoplelova, N. A., et al. Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).
- Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).
- Kotova, Y., et al. Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin αIIbβ3 and fibrinogen. Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).
- Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).
- Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry. Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).
- Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. Fluorescence analysis of receptor−G protein interactions in cell membranes. Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).
- Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding. Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).
- De Franceschi, N., et al. ProLIF – Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes. Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).
