Her presenterer vi fabrikasjonsmetoden til et optrode-system med optiske fibre for lyslevering og en elektrodematrise for nevral opptak. In vivo eksperimenter med transgene mus som uttrykker channelrhodopsin-2 viser gjennomførbarheten av systemet for samtidig optogenetisk stimulering og elektrofysiologisk opptak.
I løpet av det siste tiåret har optogenetikk blitt et viktig verktøy for undersøkelse av nevral signalering på grunn av sin unike evne til selektiv nevral modulasjon eller overvåking. Som spesifikke typer nevronceller kan genetisk modifiseres for å uttrykke opsinproteiner, muliggjør optogenetikk optisk stimulering eller hemming av de valgte nevronene. Det har vært flere teknologiske fremskritt i det optiske systemet for optogenetikk. Nylig ble det foreslått å kombinere den optiske bølgelederen for lyslevering med elektrofysiologisk opptak for samtidig å overvåke nevrale responser på optogenetisk stimulering eller hemming. I denne studien ble en implanterbar optrode array (2×2 optiske fibre) utviklet med innebygde flerkanalselektroder.
En lysdiode (LED) ble brukt som lyskilde, og et mikrofabrikkert mikrolens array ble integrert for å gi tilstrekkelig lyseffekt på spissen av de optiske fibrene. Optrode array-systemet består av engangsdelen og den gjenbrukbare delen. Engangsdelen har optiske fibre og elektroder, mens den gjenbrukbare delen har LED og elektroniske kretser for lyskontroll og nevral signalbehandling. Den nye utformingen av det implanterbare optrode array-systemet er introdusert i den medfølgende videoen i tillegg til prosedyren for optrodimplantasjonskirurgi, optogenetisk lysstimulering og elektrofysiologisk nevral registrering. Resultatene av in vivo-eksperimenter viste vellykket tidslåste nevrale pigger fremkalt av lysstimuliene fra hippocampale eksitatoriske nevroner av mus.
Registrering og kontroll av nevral aktivitet er avgjørende for å forstå hvordan hjernen fungerer i et nevralt nettverk og på cellulære nivåer. Konvensjonelle elektrofysiologiske opptaksmetoder inkluderer patchklemmen 1,2,3,4 ved hjelp av en mikropipette og ekstracellulær opptak ved hjelp av mikroneurale elektroder 5,6,7,8. Som en nevromoduleringsmetode har elektrisk stimulering ofte blitt brukt til å stimulere en fokal hjerneregion direkte eller indirekte depolarisering av nevronceller direkte. Den elektriske metoden kan imidlertid ikke skille mellom nevronale celletyper for registrering eller stimulering fordi de elektriske strømmene sprer seg i alle retninger.
Som en ny teknologi har optogenetikk innledet en ny epoke for å forstå hvordan nervesystemet fungerer 9,10,11,12,13,14,15,16. Essensen av optogenetiske teknikker er å bruke lys for å kontrollere aktiviteten til lysfølsomme opsinproteiner uttrykt av genetisk modifiserte celler. Dermed muliggjør optogenetikk den sofistikerte moduleringen eller overvåkingen av genetisk utvalgte celler i kompliserte nevrale kretser14,17. Den bredere bruken av den optogenetiske tilnærmingen har nødvendiggjort samtidig nevral registrering for å direkte bekrefte optisk nevromodulering. Derfor vil en integrert enhet med lyskontroll og opptaksfunksjoner være ekstremt verdifull 16,18,19,20,21,22,23,24,25.
Det er begrensninger i konvensjonell, laserbasert optogenetisk stimulering, som krever et klumpete og dyrt lysleveringssystem 26,27,28,29,30. Derfor brukte noen forskningsgrupper μLED-baserte silisiumsonder for å minimere størrelsen på lysleveringssystemet 31,32,33,34. Det er imidlertid en risiko for termisk hjerneskade forårsaket av direkte kontakt med μLEDer på grunn av den lave energikonverteringseffektiviteten til lysdioder. Lysbølgeledere, som optiske fibre, SU-8 og silisiumoksynitrid (SiON), er påført for å unngå termisk skade 30,35,36,37,38,39. Denne strategien har imidlertid også en ulempe på grunn av den lave koblingseffektiviteten mellom lyskilder og bølgelederne.
Mikrolens-arrayet ble tidligere introdusert for å forbedre lyskoblingseffektiviteten mellom lysdioder og optiske fibre40. Et optrode-system ble utviklet basert på mikroelektromekaniske systemer (MEMS) teknologier for optisk stimulering og elektrisk opptak på en mikroskala40. Mikrolens-arrayet mellom en LED og optiske fibre økte lyseffektiviteten med 3,13 dB. Som vist i figur 1, er en 2×2 optisk fibermatrise justert på 4×4 mikrolens-arrayet, og LED-lampen er plassert under mikrolens-arrayet. De 2×2 optiske fibrene er montert i stedet for 4×4 for å redusere hjerneskade. En wolframelektrodematrise er plassert ved siden av optrode-matrisen ved hjelp av silisium via hull for elektrofysiologisk opptak (figur 1B).
Systemet består av en topp engangsdel og avtakbare bunndeler. Den øverste engangsdelen, som inkluderer den optiske fibermatrisen, mikrolens arrayet og wolframelektrode arrayet, er designet for å implanteres permanent i hjernen for in vivo-eksperimenter . Den nederste delen inkluderer en LED-lyskilde og en ekstern strømforsyningslinje, som er lett flyttbar og gjenbrukbar for et annet dyreforsøk. Et plastdeksel som kan festes, beskytter engangsdelen når den avtakbare delen fjernes.
Gjennomførbarheten av systemet er verifisert ved implantasjon i hjernen til transgene mus som uttrykker channelrhodopsin-2 (ChR2) i Ca2 +/calmodulin-avhengig protein kinase II-positive nevroner (CaMKIIα::ChR2 mus). Registrering av elektroder ble brukt til å registrere nevrale aktiviteter fra individuelle nevroner under optisk stimulering av nevronene.
Gjennomførbarheten av systemet for samtidig optogenetisk stimulering og elektrofysiologisk opptak ble verifisert (figur 6). De store piggene under lysstimulering er fotoelektriske artefakter som forekommer samtidig med lysstimuleringen (figur 6A). Dette er tydelig i den zoomede visningen av bølgeformen i det røde stiplede rektangelet (figur 6A). Som vist i figur 6A, kunne de fotoelektriske artefakten…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av Convergent Technology R&D Program for Human Augmentation gjennom National Research Foundation of Korea (NRF), finansiert av Ministry of Science and ICT (NRF-2019M3C1B8090805), og støttet av et National Research Foundation of Korea (NRF) stipend finansiert av Korea-regjeringen (MSIT) (nr. 2019R1A2C1088909). Vi takker Seung-Hee Lees laboratorium ved Institutt for biovitenskap, KAIST, Daejeon, Korea, for vennlig å gi de transgene musene.
5-pin Connector | NW3 | HD127K | 1.27 mm (.050") pitch |
Bovie | Fine Science Tools(F.S.T) | 18010-00 | High Temperature Cautery Kit |
Data Acquisition Software | Intan Technologies, LLC | USB Interface Board software | Work with the RHD USB Interface Board |
Dental Cement | Lang Dental Manufacturing Company, Inc. | 1223CLR | Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package |
Digital Manipulator Arm | Stoelting Co. | 51904/51906 | Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On |
Gel Foam | Cutanplast | Standard (70*50*10 mm) | Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect |
Headstage Preamplifier | Intan Technologies, LLC | #C3314 | RHD 16-Channel Recording Headstages |
Heating Pad | Stoelting Co. | 53800R | Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad |
LED | OSLON | GB CS8PM1.13 | λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V |
MATLAB | MathWorks, Inc. | R2019a | |
Micro Clamp | SURGIWAY | 12-1002-04 | Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm |
Optical Fiber | Thorlabs, Inc. | FT200UMT | 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 – 1200 nm |
PFA-Coated Tungsten Wire | A-M System | Custom ordered | Rod type, Ø 101.6 μm (.004") |
Photodiode | Thorlabs | S121C | |
power meter | Thorlabs Inc. | PM100D | |
Precision cleaver | FITEL | S326 | Fiber slicer tool |
Prism | GraphPad | 5.01 version | |
Scalpel | Feather™ | #20 | Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle |
screw | Nasa Korea | stainless steel | diameter: 1.2 mm, length: 3 mm |
Silver Wire | The Nilaco Corporation | AG-401265 | Ø 200 µm |
Stereotaxic Fxrame | Stoelting Co. | 51500D | Digital new standard stereotaxic, rat and mouse |
suture | ETHICON | W9106 | suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0 |
Vaseline | Unilever PLC | Original | 100% pure petroleum jelly |
Wave_Clus | N/A | N/A | https://github.com/csn-le/wave_clus |