Выделение и функциональный анализ артериолярного эндотелия паренхимы головного мозга мыши
Summary
Проиллюстрирована интенсивная подготовка интактных эндотелиальных «трубок» головного мозга мыши из церебральных паренхиматозных артериол для изучения регуляции мозгового кровотока. Кроме того, мы демонстрируем экспериментальные сильные стороны этой модели эндотелиального исследования для флуоресцентной визуализации и электрофизиологического измерения ключевых клеточных сигнальных путей, включая изменения внутриклеточного [Ca2+] и мембранного потенциала.
Abstract
Мозговой кровоток передается сосудистыми артериями сопротивления и ниже по течению паренхиматозными артериолами. Устойчивое сосудистое сопротивление кровотоку увеличивается с уменьшением диаметра от артерий до артериол, которые в конечном итоге питаются капиллярами. Из-за их меньшего размера и расположения в паренхиме артериолы были относительно недостаточно изучены и с меньшей воспроизводимостью в результатах, чем поверхностные пиальные артерии. Несмотря на это, структура и функция артериолярных эндотелиальных клеток, неотъемлемая часть физиологии и этиологии хронических дегенеративных заболеваний, требует обширного исследования. В частности, новые данные демонстрируют, что нарушенная функция эндотелия предшествует и усугубляет когнитивные нарушения и деменцию.
В паренхиматозной микроциркуляции функция эндотелиального канала K+ является наиболее надежным стимулом для тонкого контроля распространения вазодилатации, чтобы способствовать увеличению притока крови к областям нейрональной активности. Эта статья иллюстрирует усовершенствованный метод свежеизолирования интактных и электрически связанных эндотелиальных «трубок» (диаметр, ~25 мкм) из паренхиматозных артериол мозга мыши. Артериолярные эндотелиальные трубки обеспечиваются в физиологических условиях (37 °C, рН 7,4) для разрешения экспериментальных переменных, которые охватывают функцию канала K+ и их регуляцию, включая внутриклеточную динамику Ca2+ , изменения мембранного потенциала и мембранную липидную регуляцию. Явным техническим преимуществом по сравнению с артериальным эндотелием является улучшенное морфологическое разрешение размеров клеток и органелл (например, митохондрий), что расширяет полезность этого метода. Здоровая церебральная перфузия на протяжении всей жизни влечет за собой надежную функцию эндотелия в паренхиматозных артериолах, напрямую связывая кровоток с подпиткой нейронной и глиальной активности в точных анатомических областях мозга. Таким образом, ожидается, что этот метод значительно расширит общие знания сосудистой физиологии и неврологии относительно здорового и больного мозга.
Introduction
Паренхиматозные артериолы непосредственно доставляют необходимый кислород и питательные вещества по всему мозгу1. Взаимодействуя с капиллярами, высоковазоактивные артериолы реагируют на ретроградную передачу сигналов, инициированную капиллярными ионными каналами, которые воспринимают метаболические сигналы от определенных нейронныхобластей 2. Поскольку паренхима головного мозга исторически получила основную часть исследований, в настоящее время появилась роль эндотелиальной дисфункции для прояснения патологических механизмов, связанных с различными цереброваскулярными нарушениями, лежащими в основе деменции (например, ишемический инсульт, болезнь Альцгеймера)3,4,5,6 . Эндотелий является неотъемлемой частью перфузии мозга в соответствии с неоднородностью генетики, структуры и функции во всех сосудистых сегментах7. Пиальные артерии были широко изучены из-за их относительно большого размера, высокого сегментарного сосудистого сопротивления и роли в распределении кровотока к подлежащему церебру 8,9. Таким образом, лучшее понимание артериолярных эндотелиальных механизмов, вероятно, улучшит понимание регуляции мозгового кровотока в здоровье и болезнях в направлении разработки новых терапевтических схем.
Новые данные подчеркивают важность изучения паренхиматозных артериол в отношении различных сигнальных путей и заболеваний 8,10. Однако этот подход был ограничен использованием интактных артериол под давлением11 и/или препаратов12 капиллярно-паренхиматозной артериолы (CaPA). Свежеизолированные, нативные артериолярные эндотелиальные клетки головного мозга, лишенные других типов клеток и смешивающих факторов, не были исследованы, вероятно, из-за технических трудностей в их изоляции. В этой статье продвигается предыдущая методика, подчеркивающая выделение эндотелия пиальной артерии13, чтобы теперь надежно и воспроизводимо изолировать эндотелий паренхиматозных артериол головного мозга (ширина: ~ 25 мкм, длина: ~ 250 мкм). Этот метод помогает достичь оптимального разрешения электрически и химически связанных клеток в их индивидуальной ориентации и сотовых сетях.
Ключевые пути, представляющие интерес, включали взаимодействие внутриклеточной передачи сигналов Ca2+ ([Ca2+]i) и гиперполяризацию мембранного потенциала (Vm)14,15 — неотъемлемого элемента вазодилатации16 — чтобы позволить крови проникать в капилляры и доставлять кислород и питательные вещества в активную паренхиму17. Эти препараты позволяют проводить электрофизиологические записи ионных каналов в режиме реального времени, включая Ca2+-пермеантные, переходные рецепторные потенциалы (TRP) и K+ каналы и / или флуоресцентную визуализацию внутриклеточных органелл в эндотелиальных клеточных трубках в почти физиологических условиях. Это подходящий метод для исследователей, заинтересованных в физиологических клеточных механизмах, которые управляют эндотелиальным клеточным контролем мозгового кровотока до паренхимы мозга. В целом, этот метод поможет исследователям лучше понять фундаментальные эндотелиальные сигнальные пути и сетевую связь артериол, встроенных в паренхиму головного мозга, при решении вопросов, связанных с цереброваскулярной физиологией и патологией.
Protocol
Representative Results
Discussion
Растущие данные свидетельствуют о том, что цереброваскулярные заболевания (ССЗ), старение и болезнь Альцгеймера сильно коррелируют и являются актуальной темой исследований деменции 4,8,14,21. Таким образом, очевидно, ч?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами Национальных институтов здравоохранения (R00AG047198 & R56AG062169 для EJB; R00HL140106 к PWP) и Ассоциации Альцгеймера (AZRGD-21-805835 к PWP). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения или Ассоциации Альцгеймера.
Materials
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
Referências
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer’s disease: Is Alzheimer’s a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer’s disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
- Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316 (2018).
- Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer’s disease. Function. 2 (2), (2021).
- Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).
- Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).
- Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).
- Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
- Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).
- Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer’s disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
- Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
- Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer’s disease–lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206 (2014).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
- Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
- Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
- Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413 (2020).
- Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
- Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).
