Isolement et analyse fonctionnelle de l’endothélium artériolaire du parenchyme cérébral de souris
Summary
La préparation intensive de « tubes » endothéliaux cérébraux intacts de souris à partir d’artérioles parenchymateuses cérébrales est illustrée pour étudier la régulation du flux sanguin cérébral. De plus, nous démontrons les forces expérimentales de ce modèle d’étude endothéliale pour l’imagerie par fluorescence et la mesure électrophysiologique des principales voies de signalisation cellulaire, y compris les changements dans le potentiel intracellulaire [Ca2+] et membranaire.
Abstract
Le flux sanguin cérébral est véhiculé par les artères de résistance vasculaire et les artérioles parenchymateuses en aval. La résistance vasculaire à l’état d’équilibre au flux sanguin augmente avec la diminution du diamètre des artères aux artérioles qui alimentent finalement les capillaires. En raison de leur plus petite taille et de leur emplacement dans le parenchyme, les artérioles ont été relativement peu étudiées et avec moins de reproductibilité dans les résultats que les artères piales de surface. Quoi qu’il en soit, la structure et la fonction des cellules endothéliales artériolaires – qui font partie intégrante de la physiologie et de l’étiologie des maladies dégénératives chroniques – nécessitent une enquête approfondie. En particulier, de nouvelles preuves démontrent que la fonction endothéliale compromise précède et exacerbe les troubles cognitifs et la démence.
Dans la microcirculation parenchymateuse, la fonction endothéliale du canal K + est le stimulus le plus robuste pour contrôler finement la propagation de la vasodilatation afin de favoriser l’augmentation du flux sanguin vers les zones d’activité neuronale. Cet article illustre une méthode raffinée pour isoler fraîchement des « tubes » endothéliaux intacts et couplés électriquement (diamètre, ~ 25 μm) à partir d’artérioles parenchymateuses du cerveau de souris. Les tubes endothéliaux artériolaires sont fixés dans des conditions physiologiques (37 °C, pH 7,4) pour résoudre les variables expérimentales qui englobent la fonction du canal K+ et leur régulation, y compris la dynamique intracellulaire du Ca2+ , les changements dans le potentiel membranaire et la régulation des lipides membranaires. Un avantage technique distinct par rapport à l’endothélium artériel est la résolution morphologique améliorée des dimensions des cellules et des organites (par exemple, les mitochondries), ce qui élargit l’utilité de cette technique. Une perfusion cérébrale saine tout au long de la vie implique une fonction endothéliale robuste dans les artérioles parenchymateuses, reliant directement le flux sanguin à l’alimentation de l’activité neuronale et gliale dans des régions anatomiques précises du cerveau. Ainsi, on s’attend à ce que cette méthode fasse progresser de manière significative les connaissances générales en physiologie vasculaire et en neurosciences concernant le cerveau sain et malade.
Introduction
Les artérioles parenchymateuses fournissent directement de l’oxygène et des nutriments essentiels dans tout le cerveau1. Lors de l’interfaçage avec les capillaires, les artérioles hautement vasoactives répondent à la signalisation rétrograde initiée par les canaux ioniques capillaires qui détectent les signaux métaboliques de régions neuronales spécifiques2. Le parenchyme cérébral ayant historiquement fait l’objet de la majeure partie des recherches, un rôle pour le dysfonctionnement endothélial est maintenant apparu pour clarifier les mécanismes pathologiques associés à divers troubles cérébrovasculaires qui sous-tendent la démence (par exemple, accident vasculaire cérébral ischémique, maladie d’Alzheimer)3,4,5,6 . L’endothélium fait partie intégrante de la perfusion du cerveau en accord avec l’hétérogénéité de la génétique, de la structure et de la fonction dans les segments vasculaires7. Les artères piales ont été largement étudiées en raison de leur taille relativement grande, de leur résistance vasculaire segmentaire élevée et de leur rôle dans la distribution du flux sanguin vers le cerveau sous-jacent 8,9. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes endothéliaux artériolaires améliorera probablement la compréhension de la régulation du flux sanguin cérébral dans la santé et la maladie en vue du développement de nouveaux schémas thérapeutiques.
De nouvelles preuves soulignent l’importance d’étudier les artérioles parenchymateuses en relation avec différentes voies de signalisation et maladies 8,10. Cependant, cette approche s’est limitée à l’utilisation de préparations intactes d’artériole11 sous pression et/ou d’artériole capillaire-parenchymateuse (CaPA)12. Les cellules endothéliales artériolaires cérébrales natives fraîchement isolées et dépourvues d’autres types de cellules et de facteurs de confusion n’ont pas été examinées, probablement en raison de difficultés techniques dans leur isolement. Cet article avance une technique antérieure mettant en évidence l’isolement de l’endothélium artériel pial13 pour isoler maintenant de manière fiable et reproductible l’endothélium des artérioles parenchymateuses du cerveau (largeur: ~25 μm, longueur: ~250 μm). Cette technique permet d’obtenir une résolution optimale des cellules couplées électriquement et chimiquement dans leur orientation individuelle et leurs réseaux cellulaires.
Les principales voies d’intérêt ont inclus l’interaction de la signalisation intracellulaire ca2+ ([Ca2+]i) et l’hyperpolarisation du potentiel membranaire (Vm)14,15 – partie intégrante de la vasodilatation16 – pour permettre au sang de pénétrer dans les capillaires et de fournir de l’oxygène et des nutriments au parenchymeactif 17. Ces préparations permettent des enregistrements électrophysiologiques en temps réel des canaux ioniques, y compris les canaux ca2+-perméants, le potentiel récepteur transitoire (TRP) et les canaux K+ et/ou l’imagerie fluorescente des organites intracellulaires dans les tubes cellulaires endothéliaux dans des conditions quasi physiologiques. Il s’agit d’une technique appropriée pour les chercheurs intéressés par les mécanismes cellulaires physiologiques qui régissent le contrôle des cellules endothéliales de l’administration du flux sanguin cérébral au parenchyme cérébral. Dans l’ensemble, cette technique aidera les chercheurs à mieux comprendre les voies fondamentales de signalisation endothéliale et la communication en réseau des artérioles intégrées dans le parenchyme cérébral tout en abordant les questions liées à la physiologie et à la pathologie cérébrovasculaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
De plus en plus de preuves suggèrent que les maladies cérébrovasculaires (MCV), le vieillissement et la maladie d’Alzheimer sont fortement corrélés et constituent un sujet actuel de recherche sur la démence 4,8,14,21. Ainsi, il est évident que les études du réseau cérébrovasculaire auraient un large impact sur la santé tout en nécessitant une enquête approfondie et continue pend…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par des subventions des National Institutes of Health (R00AG047198 & R56AG062169 à EJB; R00HL140106 à PWP) et l’Alzheimer’s Association (AZRGD-21-805835 à PWP). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels des National Institutes of Health ou de l’Alzheimer’s Association.
Materials
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
Referências
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