माउस मस्तिष्क पैरेन्काइमा के धमनीविस्फार एंडोथेलियम का अलगाव और कार्यात्मक विश्लेषण
Summary
सेरेब्रल पैरेन्काइमल आर्टेरियोल्स से बरकरार माउस सेरेब्रल एंडोथेलियल “ट्यूब” की गहन तैयारी को सेरेब्रल रक्त प्रवाह विनियमन का अध्ययन करने के लिए सचित्र किया गया है। इसके अलावा, हम प्रतिदीप्ति इमेजिंग और प्रमुख सेलुलर सिग्नलिंग मार्गों के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी माप के लिए इस एंडोथेलियल अध्ययन मॉडल की प्रयोगात्मक शक्तियों का प्रदर्शन करते हैं, जिसमें इंट्रासेल्युलर [सीए2+] और झिल्ली क्षमता में परिवर्तन शामिल हैं।
Abstract
सेरेब्रल रक्त प्रवाह संवहनी प्रतिरोध धमनियों और डाउनस्ट्रीम पैरेन्काइमल धमनियों द्वारा व्यक्त किया जाता है। रक्त प्रवाह के लिए स्थिर-राज्य संवहनी प्रतिरोध धमनियों से धमनियों तक घटते व्यास के साथ बढ़ता है जो अंततः केशिकाओं में फ़ीड करते हैं। पैरेन्काइमा में उनके छोटे आकार और स्थान के कारण, धमनियों को अपेक्षाकृत कम अध्ययन किया गया है और सतह की पायल धमनियों की तुलना में निष्कर्षों में कम पुनरुत्पादन के साथ। भले ही, धमनीविस्फार एंडोथेलियल सेल संरचना और कार्य-पुरानी अपक्षयी बीमारियों के शरीर विज्ञान और एटियलजि के अभिन्न अंग-व्यापक जांच की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, उभरते हुए सबूत दर्शाते हैं कि समझौता किए गए एंडोथेलियल फ़ंक्शन संज्ञानात्मक हानि और मनोभ्रंश से पहले और बढ़ाता है।
पैरेन्काइमल माइक्रोसर्कुलेशन में, एंडोथेलियल के + चैनल फ़ंक्शन न्यूरोनल गतिविधि के क्षेत्रों में रक्त प्रवाह में वृद्धि को बढ़ावा देने के लिए वासोडिलेशन के प्रसार को बारीकी से नियंत्रित करने के लिए सबसे मजबूत उत्तेजना है। यह पेपर माउस मस्तिष्क पैरेन्काइमल धमनियों से बरकरार और विद्युत रूप से युग्मित एंडोथेलियल “ट्यूब” (व्यास, ~ 25 μm) को ताजा अलग करने के लिए एक परिष्कृत विधि दिखाता है। धमनीविस्फार एंडोथेलियल ट्यूबों को शारीरिक स्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस, पीएच 7.4) के दौरान सुरक्षित किया जाता है ताकि प्रयोगात्मक चर को हल किया जा सके जो के + चैनल फ़ंक्शन और उनके विनियमन को शामिल करते हैं, जिसमें इंट्रासेल्युलर सीए2 + गतिशीलता, झिल्ली क्षमता में परिवर्तन और झिल्ली लिपिड विनियमन शामिल हैं। धमनी एंडोथेलियम बनाम एक अलग तकनीकी लाभ सेल और ऑर्गेनेल (जैसे, माइटोकॉन्ड्रिया) आयामों का बढ़ाया रूपात्मक संकल्प है, जो इस तकनीक की उपयोगिता का विस्तार करता है। पूरे जीवन में स्वस्थ सेरेब्रल परफ्यूजन पैरेन्काइमल आर्टेरियोल्स में मजबूत एंडोथेलियल फ़ंक्शन पर जोर देता है, जो मस्तिष्क के सटीक शारीरिक क्षेत्रों में न्यूरोनल और ग्लियाल गतिविधि के ईंधन के लिए सीधे रक्त प्रवाह को जोड़ता है। इस प्रकार, यह उम्मीद की जाती है कि यह विधि स्वस्थ और रोगग्रस्त मस्तिष्क से संबंधित संवहनी शरीर विज्ञान और तंत्रिका विज्ञान के सामान्य ज्ञान को काफी आगे बढ़ाएगी।
Introduction
पैरेन्काइमल धमनियां सीधे मस्तिष्क में आवश्यक ऑक्सीजन और पोषक तत्व प्रदान करतीहैं 1। केशिकाओं के साथ इंटरफेसिंग करते समय, अत्यधिक वासोएक्टिव धमनियां केशिका आयन चैनलों द्वारा शुरू किए गए प्रतिगामी सिग्नलिंग का जवाब देती हैं जो विशिष्ट न्यूरोनल क्षेत्रों से चयापचय संकेतों को समझतीहैं। मस्तिष्क पैरेन्काइमा के साथ ऐतिहासिक रूप से जांच का थोक प्राप्त करने के साथ, एंडोथेलियल डिसफंक्शन के लिए एक भूमिका अब विभिन्न सेरेब्रोवास्कुलर विकारों से जुड़े पैथोलॉजिकल तंत्र को स्पष्ट करने के लिए उभरी है जो मनोभ्रंश (जैसे, इस्केमिक स्ट्रोक, अल्जाइमर रोग) को रेखांकित करती है 3,4,5,6 . एंडोथेलियम पूरे संवहनी खंडों में आनुवांशिकी, संरचना और कार्य की विषमता के अनुरूप मस्तिष्क के परफ्यूजन के लिए अभिन्नअंग है। पायल धमनियों को उनके अपेक्षाकृत बड़े आकार, उच्च खंडीय संवहनी प्रतिरोध, और अंतर्निहित सेरेब्रम 8,9 में रक्त प्रवाह वितरण में भूमिका के कारण बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। इस प्रकार, धमनीविस्फार एंडोथेलियल तंत्र की बेहतर समझ संभवतः उपन्यास चिकित्सीय आहार के विकास की दिशा में स्वास्थ्य और बीमारी में मस्तिष्क रक्त प्रवाह विनियमन की समझ को बढ़ाएगी।
उभरते हुए साक्ष्य विभिन्न सिग्नलिंग मार्गों और बीमारियों के संबंध में पैरेन्काइमल धमनियों के अध्ययन के महत्व पर प्रकाश डालतेहैं 8,10। हालांकि, इस दृष्टिकोण को बरकरार दबाव वाले आर्टेरियोल11 और / या केशिका-पैरेन्काइमल आर्टेरियोल (सीएपीए) तैयारी12 का उपयोग करने तक सीमित कर दिया गया है। ताजा अलग-थलग, देशी सेरेब्रल आर्टेरिओलर एंडोथेलियल कोशिकाएं अन्य सेल प्रकारों और भ्रमित कारकों से रहित हैं, उनकी जांच नहीं की गई है, संभवतः उनके अलगाव में तकनीकी कठिनाइयों के कारण। यह पेपर एक पिछली तकनीक को आगे बढ़ाता है जो पियाल धमनी एंडोथेलियम13 के अलगाव को उजागर करता है, अब मज़बूती से और मस्तिष्क पैरेन्काइमल धमनियों के एंडोथेलियम को अलग करता है (चौड़ाई: ~ 25 μm, लंबाई: ~ 250 μm)। यह तकनीक उनके व्यक्तिगत अभिविन्यास और सेलुलर नेटवर्क में विद्युत और रासायनिक रूप से युग्मित कोशिकाओं के इष्टतम संकल्प को प्राप्त करने में मदद करती है।
ब्याज के प्रमुख मार्गों में इंट्रासेल्युलर सीए2 + ([सीए2 +] i) की बातचीत शामिल है झिल्ली क्षमता (वीएम) 14,15 के सिग्नलिंग और हाइपरपोलराइजेशन – वासोडिलेशन16 के लिए अभिन्न – रक्त को केशिकाओं में प्रवेश करने और सक्रिय पैरेन्काइमा17 को ऑक्सीजन और पोषक तत्वों को वितरित करने की अनुमति देने के लिए। ये तैयारी आयन चैनलों की वास्तविक समय की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देती हैं, जिसमें Ca2 + – permeant, क्षणिक रिसेप्टर क्षमता (टीआरपी) और K + चैनल और / या एंडोथेलियल सेल ट्यूबों के भीतर इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल की फ्लोरोसेंट इमेजिंग शामिल हैं। यह शारीरिक सेलुलर तंत्र में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए एक उपयुक्त तकनीक है जो मस्तिष्क पैरेन्काइमा में सेरेब्रल रक्त प्रवाह वितरण के एंडोथेलियल सेल नियंत्रण को नियंत्रित करती है। कुल मिलाकर, यह तकनीक शोधकर्ताओं को सेरेब्रोवास्कुलर फिजियोलॉजी और पैथोलॉजी से संबंधित प्रश्नों को संबोधित करते हुए मस्तिष्क पैरेन्काइमा में एम्बेडेड धमनियों के मौलिक एंडोथेलियल सिग्नलिंग मार्गों और नेटवर्क संचार को बेहतर ढंग से समझने में मदद करेगी।
Protocol
Representative Results
Discussion
बढ़ते सबूत बताते हैं कि सेरेब्रोवास्कुलर रोग (सीवीडी), उम्र बढ़ने और अल्जाइमर रोग दृढ़ता से सहसंबद्ध हैं और मनोभ्रंश अनुसंधान 4,8,14,21 का एक वर्तमान विषय हैं।…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (R00AG047198 और R56AG062169 से EJB को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है; R00HL140106 PWP के लिए) और अल्जाइमर एसोसिएशन (AZRGD-21-805835 PWP के लिए)। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान या अल्जाइमर एसोसिएशन के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करे।
Materials
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
Referências
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