La preparazione intensiva di “tubi” endoteliali cerebrali di topo intatti da arteriole parenchimali cerebrali è illustrata per lo studio della regolazione del flusso sanguigno cerebrale. Inoltre, dimostriamo i punti di forza sperimentali di questo modello di studio endoteliale per l’imaging a fluorescenza e la misurazione elettrofisiologica delle principali vie di segnalazione cellulare, compresi i cambiamenti nel potenziale intracellulare [Ca2+] e di membrana.
Il flusso sanguigno cerebrale è trasmesso dalle arterie di resistenza vascolare e dalle arteriole parenchimali a valle. La resistenza vascolare allo stato stazionario al flusso sanguigno aumenta con la diminuzione del diametro dalle arterie alle arteriole che alla fine alimentano i capillari. A causa delle loro dimensioni e posizione più piccole nel parenchima, le arteriole sono state relativamente poco studiate e con una minore riproducibilità nei reperti rispetto alle arterie piali superficiali. Indipendentemente da ciò, la struttura e la funzione delle cellule endoteliali arteriolari, parte integrante della fisiologia e dell’eziologia delle malattie degenerative croniche, richiedono un’indagine approfondita. In particolare, prove emergenti dimostrano che la funzione endoteliale compromessa precede ed esacerba il deterioramento cognitivo e la demenza.
Nella microcircolazione parenchimale, la funzione del canale K+ endoteliale è lo stimolo più robusto per controllare finemente la diffusione della vasodilatazione per promuovere aumenti del flusso sanguigno verso le aree di attività neuronale. Questo documento illustra un metodo raffinato per isolare di nuovo “tubi” endoteliali intatti ed accoppiati elettricamente (diametro, ~ 25 μm) dalle arteriole parenchimali del cervello di topo. I tubi endoteliali arteriolari sono fissati durante le condizioni fisiologiche (37 °C, pH 7,4) per risolvere le variabili sperimentali che comprendono la funzione del canale K+ e la loro regolazione, tra cui la dinamica intracellulare di Ca2+ , i cambiamenti nel potenziale di membrana e la regolazione lipidica di membrana. Un netto vantaggio tecnico rispetto all’endotelio arterioso è la maggiore risoluzione morfologica delle dimensioni delle cellule e degli organelli (ad esempio, i mitocondri), che espande l’utilità di questa tecnica. Una sana perfusione cerebrale per tutta la vita comporta una robusta funzione endoteliale nelle arteriole parenchimali, collegando direttamente il flusso sanguigno all’alimentazione dell’attività neuronale e gliale in precise regioni anatomiche del cervello. Pertanto, si prevede che questo metodo farà progredire significativamente la conoscenza generale della fisiologia vascolare e delle neuroscienze riguardanti il cervello sano e malato.
Le arteriole parenchimali forniscono direttamente ossigeno e sostanze nutritive essenziali in tutto il cervello1. Durante l’interfacciamento con i capillari, le arteriole altamente vasoattive rispondono alla segnalazione retrograda avviata dai canali ionici capillari che rilevano i segnali metabolici provenienti da specifiche regioni neuronali2. Con il parenchima cerebrale che ha storicamente ricevuto la maggior parte delle indagini, è ora emerso un ruolo per la disfunzione endoteliale per chiarire i meccanismi patologici associati a vari disturbi cerebrovascolari che sono alla base della demenza (ad esempio, ictus ischemico, morbo di Alzheimer)3,4,5,6 . L’endotelio è parte integrante della perfusione del cervello in accordo con l’eterogeneità della genetica, della struttura e della funzione in tutti i segmenti vascolari7. Le arterie piali sono state ampiamente studiate a causa delle loro dimensioni relativamente grandi, dell’elevata resistenza vascolare segmentale e del ruolo nella distribuzione del flusso sanguigno al cervello sottostante 8,9. Pertanto, una migliore comprensione dei meccanismi endoteliali arteriolari probabilmente migliorerà la comprensione della regolazione del flusso sanguigno cerebrale in salute e malattia verso lo sviluppo di nuovi regimi terapeutici.
Le evidenze emergenti evidenziano l’importanza di studiare le arteriole parenchimali in relazione a diverse vie di segnalazione e malattie 8,10. Tuttavia, questo approccio è stato limitato all’uso di arteriola11 pressurizzata intatta e / o preparazioni di arteriola capillare-parenchimale (CaPA)12. Le cellule endoteliali arteriolari cerebrali native appena isolate, prive di altri tipi di cellule e fattori confondenti non sono state esaminate, probabilmente a causa di difficoltà tecniche nel loro isolamento. Questo documento avanza una tecnica precedente che evidenzia l’isolamento dell’endotelio arterioso13 per isolare in modo affidabile e riproducibile l’endotelio delle arteriole parenchimali cerebrali (larghezza: ~ 25 μm, lunghezza: ~ 250 μm). Questa tecnica aiuta a raggiungere una risoluzione ottimale delle cellule accoppiate elettricamente e chimicamente nel loro orientamento individuale e nelle reti cellulari.
Le principali vie di interesse hanno incluso l’interazione della segnalazione intracellulare di Ca2+ ([Ca2+]i) e l’iperpolarizzazione del potenziale di membrana (Vm)14,15 – parte integrante della vasodilatazione16 – per consentire al sangue di entrare nei capillari e fornire ossigeno e sostanze nutritive al parenchima attivo17. Questi preparati consentono registrazioni elettrofisiologiche in tempo reale dei canali ionici, inclusi i canali Ca2+-permeant, transient receptor potential (TRP) e K+ e/o l’imaging fluorescente di organelli intracellulari all’interno di tubi cellulari endoteliali in condizioni quasi fisiologiche. Questa è una tecnica adatta per i ricercatori interessati ai meccanismi cellulari fisiologici che governano il controllo delle cellule endoteliali della consegna del flusso sanguigno cerebrale al parenchima cerebrale. Complessivamente, questa tecnica aiuterà i ricercatori a comprendere meglio le vie di segnalazione endoteliali fondamentali e la comunicazione di rete delle arteriole incorporate nel parenchima cerebrale, affrontando al contempo le domande relative alla fisiologia e alla patologia cerebrovascolare.
Prove crescenti suggeriscono che la malattia cerebrovascolare (CVD), l’invecchiamento e il morbo di Alzheimer sono fortemente correlati e sono un argomento attuale della ricerca sulla demenza 4,8,14,21. Pertanto, è ovvio che gli studi sulla rete cerebrovascolare avrebbero un ampio impatto sulla salute, pur richiedendo un’indagine approfondita continua durante le condizioni di malattia. Come pu…
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni del National Institutes of Health (R00AG047198 & R56AG062169 a EJB; R00HL140106 a PWP) e l’Alzheimer’s Association (AZRGD-21-805835 a PWP). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health o dell’Alzheimer’s Association.
Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
Papain | Sigma | P4762 | |
Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |