Isolasjon og funksjonell analyse av arteriolar endotel av musen hjerne parenchyma
Summary
Intensiv forberedelse av intakt mus cerebral endoteliale “rør” fra cerebral parenchymale arterioler er illustrert for å studere cerebral blodstrømsregulering. Videre demonstrerer vi de eksperimentelle styrkene til denne endotelstudiemodellen for fluorescensavbildning og elektrofysiologimåling av viktige cellulære signalveier, inkludert endringer i intracellulær [Ca2+] og membranpotensial.
Abstract
Cerebral blodstrøm formidles av vaskulære resistensarterier og nedstrøms parenchymale arterioler. Steady-state vaskulær motstand mot blodstrøm øker med synkende diameter fra arterier til arterioler som til slutt mates inn i kapillærene. På grunn av deres mindre størrelse og plassering i parenchyma, har arterioler blitt relativt undervurdert og med mindre reproduserbarhet i funn enn overflatepialarterier. Uansett krever arteriolar endotelcellestruktur og funksjon – integrert i fysiologien og etiologien til kroniske degenerative sykdommer – omfattende undersøkelser. Spesielt viser nye bevis at kompromittert endotelfunksjon går foran og forverrer kognitiv svikt og demens.
I den parenchymale mikrosirkulasjonen er endotel K + kanalfunksjon den mest robuste stimulansen for å finstyre spredningen av vasodilatasjon for å fremme økning i blodstrømmen til områder av nevronaktivitet. Dette papiret illustrerer en raffinert metode for fersk isolering av intakte og elektrisk koblede endoteliale “rør” (diameter, ~ 25 μm) fra musens hjerneparenchymale arterioler. Arteriolar endotelrør er sikret under fysiologiske forhold (37 °C, pH 7,4) for å løse eksperimentelle variabler som omfatter K+ kanalfunksjon og deres regulering, inkludert intracellulær Ca2+ dynamikk, endringer i membranpotensial og membran lipidregulering. En tydelig teknisk fordel versus arteriell endotel er den forbedrede morfologiske oppløsningen av celle- og organelledimensjoner (f.eks. mitokondrier), som utvider nytten av denne teknikken. Sunn cerebral perfusjon gjennom livet innebærer robust endotelfunksjon i parenchymale arterioler, som direkte knytter blodstrømmen til drivstoff av nevronal og glial aktivitet gjennom presise anatomiske regioner i hjernen. Dermed forventes det at denne metoden vil fremme den generelle kunnskapen om vaskulær fysiologi og nevrovitenskap angående den sunne og syke hjernen betydelig.
Introduction
Parenchymale arterioler leverer direkte essensiell oksygen og næringsstoffer i hele hjernen1. Mens interfacing med kapillærer, svært vasoaktive arterioler reagerer på retrograd signalering initiert av kapillær ion kanaler som føler metabolske signaler fra spesifikke nevronale regioner2. Med hjerneparenchyma som historisk har fått mesteparten av undersøkelsen, har det nå oppstått en rolle for endoteldysfunksjon for å avklare patologiske mekanismer forbundet med ulike cerebrovaskulære lidelser som ligger til grunn for demens (f.eks. iskemisk hjerneslag, Alzheimers sykdom)3,4,5,6 . Endotelet er integrert i perfusjon av hjernen i samsvar med heterogeniteten til genetikk, struktur og funksjon gjennom vaskulære segmenter7. Pial arterier har blitt grundig studert på grunn av deres relativt store størrelse, høy segmentell vaskulær motstand, og rolle i blodstrømsfordeling til underliggende cerebrum 8,9. Dermed vil en bedre forståelse av arteriolar endotelmekanismer sannsynligvis forbedre forståelsen av hjernens blodstrømsregulering i helse og sykdom mot utvikling av nye terapeutiske regimer.
Nye bevis fremhever viktigheten av å studere parenchymale arterioler i forhold til forskjellige signalveier og sykdommer 8,10. Denne tilnærmingen har imidlertid vært begrenset til bruk av intakte trykkarteriole11 og/eller kapillær-parenchymale arteriole (CaPA) preparater12. Nyisolerte, innfødte cerebral arteriolar endotelceller uten andre celletyper og forvirrende faktorer har ikke blitt undersøkt, sannsynligvis på grunn av tekniske vanskeligheter i isolasjonen. Dette papiret fremmer en tidligere teknikk som fremhever isolering av pial arteriell endotel13 for nå pålitelig og reproduserer endothelium av hjernen parenchymale arterioler (bredde: ~ 25 μm, lengde: ~ 250 μm). Denne teknikken bidrar til å oppnå optimal oppløsning av elektrisk og kjemisk koblede celler i deres individuelle orientering og mobilnettverk.
Viktige veier av interesse har inkludert samspillet mellom intracellulær Ca2+ ([Ca2+]i) signalering og hyperpolarisering av membranpotensialet (Vm)14,15 – integrert i vasodilatasjon16 – for å tillate blod å komme inn i kapillærene og levere oksygen og næringsstoffer til aktiv parenchyma17. Disse preparatene tillater sanntids elektrofysiologiske opptak av ionkanaler, inkludert Ca2 + permeant, forbigående reseptorpotensial (TRP) og K + kanaler og / eller fluorescerende avbildning av intracellulære organeller innen endotelale cellerør under nesten fysiologiske forhold. Dette er en egnet teknikk for forskere som er interessert i fysiologiske cellulære mekanismer som styrer endotelcellekontroll av cerebral blodstrømslevering til hjernens parenchyma. Til sammen vil denne teknikken hjelpe forskere til å bedre forstå grunnleggende endotelsignaleringsveier og nettverkskommunikasjon av arterioler innebygd i hjerneparenchyma mens de tar opp spørsmål relatert til cerebrovaskulær fysiologi og patologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Økende bevis tyder på at cerebrovaskulær sykdom (CVD), aldring og Alzheimers sykdom er sterkt korrelert og er et aktuelt tema for demensforskning 4,8,14,21. Dermed er det åpenbart at studier av det cerebrovaskulære nettverket vil ha stor innvirkning på helsen samtidig som det krever fortsatt omfattende undersøkelse under sykdomstilstander. Som et betydelig punkt av vaskulær motstand for…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen har blitt støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (R00AG047198 &R56AG062169 til EJB; R00HL140106 til PWP) og Alzheimers forening (AZRGD-21-805835 til PWP). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health eller Alzheimers Association.
Materials
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
Referências
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer’s disease: Is Alzheimer’s a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer’s disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
- Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316 (2018).
- Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer’s disease. Function. 2 (2), (2021).
- Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).
- Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).
- Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).
- Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
- Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).
- Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer’s disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
- Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
- Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer’s disease–lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206 (2014).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
- Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
- Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
- Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413 (2020).
- Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
- Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).
