Isolamento e Análise Funcional do Endotélio Arteriolar do Cérebro do Rato Parenchyma
Summary
A preparação intensiva de “tubos” endoteliais cerebrais intactos de arteriolas parenchímicas cerebrais é ilustrada para o estudo da regulação do fluxo sanguíneo cerebral. Além disso, demonstramos os pontos fortes experimentais deste modelo de estudo endotelial para a medição de imagens de fluorescência e eletrofisiologia das principais vias de sinalização celular, incluindo alterações no potencial intracelular [Ca2+] e membrana.
Abstract
O fluxo sanguíneo cerebral é transmitido por artérias de resistência vascular e artérias parenchímicas a jusante. A resistência vascular de estado estável ao fluxo sanguíneo aumenta com a diminuição do diâmetro das artérias para as artérias que, em última análise, alimentam-se de capilares. Devido ao seu menor tamanho e localização no parenchyma, as artérias têm sido relativamente subestudadas e com menos reprodutibilidade em achados do que artérias piais superficiais. Independentemente disso, a estrutura e função celular endotelial arteriolar — integrante da fisiologia e etiologia de doenças crônicas degenerativas — requer uma ampla investigação. Em particular, evidências emergentes demonstram que a função endotelial comprometida precede e exacerba o comprometimento cognitivo e a demência.
Na microcirculação parênquima, a função do canal K+ endotelial é o estímulo mais robusto para controlar finamente a propagação da vasodilatação para promover o aumento do fluxo sanguíneo para áreas de atividade neuronal. Este artigo ilustra um método refinado para isolar os “tubos” endoteliais recém-isolados e eletricamente acoplados (diâmetro, ~25 μm) de artérias parenchímicas cerebrais do rato. Os tubos endoteliais arteriolares são fixados durante condições fisiológicas (37 °C, pH 7.4) para resolver variáveis experimentais que englobam a função do canal K+ e sua regulação, incluindo dinâmica intracelular Ca2+ , alterações no potencial da membrana e regulação lipídica da membrana. Uma vantagem técnica distinta versus endotélio arterial é a maior resolução morfológica das dimensões celular e organela (por exemplo, mitocôndrias), que expande a utilidade dessa técnica. Perfusão cerebral saudável ao longo da vida implica uma função endotelial robusta em artérias parenchímicas, ligando diretamente o fluxo sanguíneo ao abastecimento da atividade neuronal e gliana em regiões anatômicas precisas do cérebro. Assim, espera-se que este método avance significativamente o conhecimento geral da fisiologia vascular e da neurociência em relação ao cérebro saudável e doente.
Introduction
As artérias parenchímicas fornecem diretamente oxigênio e nutrientes essenciais em todo o cérebro1. Ao interagir com capilares, arteriolas altamente vasoativas respondem à sinalização retrógrada iniciada por canais de íons capilares que sentem sinais metabólicos de regiões neuronais específicas2. Com o parênquim cerebral tendo recebido historicamente a maior parte da investigação, um papel para a disfunção endotelial surgiu agora para esclarecer mecanismos patológicos associados a vários distúrbios cerebrovasculares que sustentam a demência (por exemplo, derrame isquêmico, doença de Alzheimer)3,4,5,6 . O endotélio é essencial para a perfusão do cérebro de acordo com a heterogeneidade da genética, estrutura e função em todos os segmentos vasculares7. As artérias piais têm sido extensivamente estudadas devido ao seu tamanho relativamente grande, alta resistência vascular segmental e papel na distribuição do fluxo sanguíneo para o cerebrum 8,9 subjacente. Assim, uma melhor compreensão dos mecanismos endoteliais arteriolares provavelmente aumentará a compreensão da regulação do fluxo sanguíneo cerebral na saúde e na doença para o desenvolvimento de novos regimes terapêuticos.
Evidências emergentes destacam a importância de estudar arteriolos parenchímicos em relação a diferentes vias de sinalização e doenças 8,10. No entanto, esta abordagem limitou-se ao uso de artéria pressurizada intacta11 e/ou preparações de arteriola capilar-parenchymal (CaPA)12. Células endoteliais arteriolares recém-isoladas e nativas desprovidas de outros tipos de células e fatores de confusão não foram examinadas, provavelmente devido a dificuldades técnicas em seu isolamento. Este artigo avança uma técnica anterior destacando o isolamento do endotélio arterial pial13 para agora isolar de forma confiável e reprodutivelmente o endotélio das artérias parenchímicas cerebrais (largura: ~25 μm, comprimento: ~250 μm). Esta técnica ajuda a alcançar a resolução ideal de células eletricamente e quimicamente acoplada em sua orientação individual e redes celulares.
Os principais caminhos de interesse incluíram a interação da sinalização intracelular Ca2+ ([Ca2+]i) e a hiperpolarização do potencial da membrana (Vm)14,15 — integral à vasodilatação16 — para permitir que o sangue entre nos capilares e entregue oxigênio e nutrientes ao parenchymaativo 17. Essas preparações permitem gravações eletrofisiológicas em tempo real de canais de íons, incluindo ca2+permeant, potencial de receptor transitório (TRP) e K+ e/ou imagens fluorescentes de organelas intracelulares dentro de tubos de células endoteliais em condições quase fisiológicas. Esta é uma técnica adequada para pesquisadores interessados em mecanismos celulares fisiológicos que regem o controle celular endotelial da entrega do fluxo sanguíneo cerebral para o parenchyma cerebral. Ao todo, essa técnica ajudará os pesquisadores a entender melhor as vias de sinalização endotelial fundamental e a comunicação em rede de arterioles incorporados no parenchyma cerebral, ao mesmo tempo em que aborda questões relacionadas à fisiologia e patologia cerebrovasculares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Evidências crescentes sugerem que a doença cerebrovascular (DCV), o envelhecimento e a doença de Alzheimer estão fortemente correlacionados e são um tópico atual de pesquisa de demência 4,8,14,21. Assim, é óbvio que estudos da rede cerebrovascular teriam um amplo impacto na saúde, ao mesmo tempo em que requerem uma investigação extensiva contínua durante as condições da doença. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (R00AG047198 & R56AG062169 para o EJB; R00HL140106 para PWP) e a Associação de Alzheimer (AZRGD-21-805835 para PWP). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde ou da Associação de Alzheimer.
Materials
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
Referências
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