Intensiv beredning av intakta mus cerebral endoteliala “rör” från cerebral parenkymala arterioler illustreras för att studera cerebral blodflödesreglering. Vidare demonstrerar vi de experimentella styrkorna hos denna endotelstudiemodell för fluorescensavbildning och elektrofysiologisk mätning av viktiga cellulära signalvägar, inklusive förändringar i intracellulär [Ca2+] och membranpotential.
Cerebralt blodflöde förmedlas av vaskulära resistensartärer och nedströms parenkymala arterioles. Steady-state vaskulär resistens mot blodflödet ökar med minskande diameter från artärer till arterioler som i slutändan matar in i kapillärer. På grund av deras mindre storlek och placering i parenkymen har arterioles varit relativt understuderade och med mindre reproducerbarhet i fynd än ytpialartärer. Oavsett, arteriolär endotelcellstruktur och funktion – integrerad i fysiologin och etiologin för kroniska degenerativa sjukdomar – kräver omfattande undersökning. I synnerhet visar nya bevis att komprometterad endotelfunktion föregår och förvärrar kognitiv försämring och demens.
I den parenkymala mikrocirkulationen är endotelial K + -kanalfunktion den mest robusta stimulansen för att fint kontrollera spridningen av vasodilatation för att främja ökningar av blodflödet till områden med neuronal aktivitet. Detta dokument illustrerar en förfinad metod för att nyligen isolera intakta och elektriskt kopplade endoteliala “rör” (diameter, ~ 25 μm) från mushjärnparenkymala arterioler. Arteriolära endotelrör säkras under fysiologiska förhållanden (37 ° C, pH 7,4) för att lösa experimentella variabler som omfattar K + -kanalfunktion och deras reglering, inklusive intracellulär Ca2 + – dynamik, förändringar i membranpotential och membranlipidreglering. En distinkt teknisk fördel jämfört med arteriell endotel är den förbättrade morfologiska upplösningen av cell- och organelldimensioner (t.ex. mitokondrier), vilket utökar användbarheten av denna teknik. Hälsosam cerebral perfusion under hela livet medför robust endotelfunktion i parenkymala arterioles, som direkt kopplar blodflödet till bränslet av neuronal och glial aktivitet i hela exakta anatomiska regioner i hjärnan. Således förväntas det att denna metod avsevärt kommer att främja den allmänna kunskapen om vaskulär fysiologi och neurovetenskap om den friska och sjuka hjärnan.
Parenkymala arterioles levererar direkt essentiellt syre och näringsämnen i hela hjärnan1. Vid samverkan med kapillärer svarar mycket vasoaktiva arterioler på retrograd signalering initierad av kapillärjonkanaler som känner av metaboliska signaler från specifika neuronala regioner2. Med hjärnparenkym som historiskt har fått huvuddelen av undersökningen har en roll för endoteldysfunktion nu uppstått för att klargöra patologiska mekanismer associerade med olika cerebrovaskulära störningar som ligger till grund för demens (t.ex. ischemisk stroke, Alzheimers sjukdom)3,4,5,6 . Endotelet är integrerat i perfusion av hjärnan i enlighet med heterogeniteten hos genetik, struktur och funktion i hela vaskulära segment7. Pialartärer har studerats i stor utsträckning på grund av deras relativt stora storlek, höga segmentella vaskulära resistens och roll i blodflödesfördelningen till den underliggande storhjärnan 8,9. Således kommer en bättre förståelse av arteriolär endotelmekanismer sannolikt att öka förståelsen för hjärnans blodflödesreglering i hälsa och sjukdom mot utvecklingen av nya terapeutiska regimer.
Nya bevis belyser vikten av att studera parenkymala arterioles i förhållande till olika signalvägar och sjukdomar 8,10. Detta tillvägagångssätt har emellertid begränsats till användning av intakta trycksatta arteriole11 och/eller kapillärparenkymala arterioleparat (CaPA)12. Nyisolerade, inhemska cerebrala arteriolära endotelceller utan andra celltyper och förvirrande faktorer har inte undersökts, sannolikt på grund av tekniska svårigheter i deras isolering. Detta dokument främjar en tidigare teknik som belyser isoleringen av pial arteriell endotel13 för att nu på ett tillförlitligt och reproducerbart sätt isolera endotelet i hjärnans parenkymala arterioler (bredd: ~ 25 μm, längd: ~ 250 μm). Denna teknik hjälper till att uppnå optimal upplösning av elektriskt och kemiskt kopplade celler i deras individuella orientering och cellulära nätverk.
Viktiga vägar av intresse har inkluderat interaktionen mellan intracellulär Ca2+ ([Ca2+]i) signalering och hyperpolarisering av membranpotential (Vm)14,15 – integrerad i vasodilatation16 – för att tillåta blod att komma in i kapillärerna och leverera syre och näringsämnen till aktivt parenkym17. Dessa preparat möjliggör elektrofysiologiska registreringar i realtid av jonkanaler, inklusive Ca2+-permeant, transient receptorpotential (TRP) och K+-kanaler och/eller fluorescerande avbildning av intracellulära organeller i endotelcellsrör under nära fysiologiska förhållanden. Detta är en lämplig teknik för forskare som är intresserade av fysiologiska cellulära mekanismer som styr endotelcellskontroll av cerebral blodflödesleverans till hjärnparenkymen. Sammantaget kommer denna teknik att hjälpa forskare att bättre förstå grundläggande endotelsignalvägar och nätverkskommunikation av arterioles inbäddade i hjärnparenkym samtidigt som man tar itu med frågor relaterade till cerebrovaskulär fysiologi och patologi.
Växande bevis tyder på att cerebrovaskulär sjukdom (CVD), åldrande och Alzheimers sjukdom är starkt korrelerade och är ett aktuellt ämne för demensforskning 4,8,14,21. Således är det uppenbart att studier av det cerebrovaskulära nätverket skulle ha en bred inverkan på hälsan samtidigt som det krävs fortsatt omfattande undersökningar under sjukdomsförhållanden. Som en viktig pu…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning har fått stöd av bidrag från National Institutes of Health (R00AG047198 & R56AG062169 till EJB; R00HL140106 till PWP) och Alzheimers Association (AZRGD-21-805835 till PWP). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health eller Alzheimers Association.
Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
Papain | Sigma | P4762 | |
Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |