Fare Beyin Parankiminin Arteriyolar Endotelinin İzolasyonu ve Fonksiyonel Analizi
Summary
Serebral parankimal arteriollerden sağlam fare serebral endotelyal “tüplerinin” yoğun bir şekilde hazırlanması, serebral kan akışı regülasyonunu incelemek için gösterilmiştir. Ayrıca, bu endotel çalışma modelinin floresan görüntüleme ve anahtar hücresel sinyal yollarının elektrofizyoloji ölçümü için, hücre içi [Ca2+] ve membran potansiyelindeki değişiklikler de dahil olmak üzere deneysel güçlerini gösteriyoruz.
Abstract
Serebral kan akımı vasküler direnç arterleri ve aşağı akış parankimal arteriolleri ile iletilir. Kan akışına karşı kararlı durum vasküler direnci, arterlerden sonuçta kılcal damarlara beslenen arteriollere kadar azalan çapla artar. Parankimdeki daha küçük boyutları ve konumları nedeniyle, arterioller nispeten az çalışılmış ve bulgularda yüzey pial arterlerine göre daha az tekrarlanabilirliğe sahiptir. Ne olursa olsun, arteriyolar endotel hücre yapısı ve fonksiyonu – kronik dejeneratif hastalıkların fizyolojisi ve etiyolojisinin ayrılmaz bir parçası – kapsamlı bir araştırma gerektirir. Özellikle, ortaya çıkan kanıtlar, tehlikeye giren endotel fonksiyonunun bilişsel bozukluk ve demanstan önce geldiğini ve şiddetlendirdiğini göstermektedir.
Parankimal mikrosirkülasyonda, endotel K + kanal fonksiyonu, nöronal aktivite alanlarına kan akışındaki artışları teşvik etmek için vazodilatasyonun yayılmasını hassas bir şekilde kontrol etmek için en sağlam uyarandır. Bu yazıda, sağlam ve elektriksel olarak eşleşmiş endotel “tüplerinin” (çap, ~ 25 μm) fare beyni parankimal arteriollerinden taze izole edilmesi için rafine bir yöntem gösterilmektedir. Arteriyolar endotel tüpleri, hücre içi Ca2+ dinamikleri, membran potansiyelindeki değişiklikler ve membran lipid regülasyonu dahil olmak üzere K + kanal fonksiyonunu ve regülasyonunu kapsayan deneysel değişkenleri çözmek için fizyolojik koşullar (37 ° C, pH 7.4) sırasında sabitlenir. Arteriyel endotele karşı belirgin bir teknik avantaj, hücre ve organel (örneğin, mitokondri) boyutlarının artmış morfolojik çözünürlüğüdür ve bu da bu tekniğin kullanışlılığını arttırır. Yaşam boyunca sağlıklı serebral perfüzyon, parankimal arteriollerde sağlam endotel fonksiyonu gerektirir ve kan akışını beynin kesin anatomik bölgeleri boyunca nöronal ve glial aktivitenin körüklenmesine doğrudan bağlar. Bu nedenle, bu yöntemin sağlıklı ve hastalıklı beyin ile ilgili vasküler fizyoloji ve sinirbilim hakkındaki genel bilgileri önemli ölçüde ilerletmesi beklenmektedir.
Introduction
Parankimal arterioller doğrudan beyin boyunca gerekli oksijen ve besinleri sağlar1. Kılcal damarlarla arayüz oluştururken, yüksek vazoaktif arterioller, spesifik nöronal bölgelerden metabolik sinyalleri algılayan kılcal iyon kanalları tarafından başlatılan retrograd sinyalizasyona yanıt verir2. Beyin parankimi tarihsel olarak araştırmanın büyük kısmını almış olmakla birlikte, endotel disfonksiyonunun rolü, demansın altında yatan çeşitli serebrovasküler bozukluklarla ilişkili patolojik mekanizmaları açıklığa kavuşturmak için ortaya çıkmıştır (örneğin, iskemik inme, Alzheimer hastalığı)3,4,5,6 . Endotel, vasküler segmentler boyunca genetiğin, yapının ve fonksiyonun heterojenliği ile uyumlu olarak beynin perfüzyonunun ayrılmaz bir parçasıdır7. Pial arterler nispeten büyük boyutları, yüksek segmental vasküler dirençleri ve altta yatan serebrum 8,9’a kan akımı dağılımındaki rolleri nedeniyle kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu nedenle, arteriyolar endotel mekanizmalarının daha iyi anlaşılması, yeni terapötik rejimlerin geliştirilmesine yönelik sağlık ve hastalıkta beyin kan akımı düzenlemesinin anlaşılmasını artıracaktır.
Ortaya çıkan kanıtlar, farklı sinyal yolları ve hastalıklarla ilgili olarak parankimal arteriollerin incelenmesinin önemini vurgulamaktadır 8,10. Bununla birlikte, bu yaklaşım sağlam basınçlı arteriol11 ve/veya kılcal-parankimal arteriol (CaPA) preparatları12 kullanımı ile sınırlıdır. Yeni izole edilmiş, diğer hücre tiplerinden yoksun doğal serebral arteriyolar endotel hücreleri ve kafa karıştırıcı faktörler, muhtemelen izolasyonlarındaki teknik zorluklar nedeniyle incelenmemiştir. Bu yazıda, pial arteriyel endotel13’ün izolasyonunu vurgulayan önceki bir teknik, beyin parankimal arteriollerinin endotelini güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde izole etmek için ilerletmektedir (genişlik: ~25 μm, uzunluk: ~250 μm). Bu teknik, elektriksel ve kimyasal olarak bağlanmış hücrelerin bireysel yönelimlerinde ve hücresel ağlarında optimum çözünürlük elde etmelerine yardımcı olur.
İlgilenilen anahtar yollar, hücre içi Ca 2 + ([Ca2 +]i) sinyallemesinin etkileşimini ve membran potansiyelinin hiperpolarizasyonunun (Vm) 14,15 – vazodilatasyonun ayrılmazbir parçası 16 – kanın kılcal damarlara girmesine ve aktif parankim 17’ye oksijen ve besin vermesine izin vermeyi içermektedir. Bu preparatlar, Ca2 + geçirgen, geçici reseptör potansiyeli (TRP) ve K + kanalları dahil olmak üzere iyon kanallarının gerçek zamanlı elektrofizyolojik kayıtlarına ve / veya endotel hücre tüpleri içindeki hücre içi organellerin floresan görüntülemesine yakın fizyolojik koşullarda izin verir. Bu, beyin parankimine serebral kan akımı iletiminin endotel hücre kontrolünü yöneten fizyolojik hücresel mekanizmalarla ilgilenen araştırmacılar için uygun bir tekniktir. Toplamda, bu teknik, araştırmacıların beyin parankimine gömülü arteriollerin temel endotel sinyal yollarını ve ağ iletişimini daha iyi anlamalarına yardımcı olurken, serebrovasküler fizyoloji ve patoloji ile ilgili soruları ele alacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Artan kanıtlar, serebrovasküler hastalık (CVD), yaşlanma ve Alzheimer hastalığının güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu ve demans araştırmalarının güncel bir konusu olduğunu göstermektedir 4,8,14,21. Bu nedenle, serebrovasküler ağ çalışmalarının sağlık üzerinde geniş bir etkiye sahip olacağı ve hastalık koşulları sırasında sürekli kapsamlı araştırmalar …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden (R00AG047198 & R56AG062169) EJB’ye; R00HL140106’dan PWP’ye) ve Alzheimer Derneği (AZRGD-21-805835’ten PWP’ye). İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri veya Alzheimer Derneği’nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
Referências
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer’s disease: Is Alzheimer’s a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer’s disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
- Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316 (2018).
- Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer’s disease. Function. 2 (2), (2021).
- Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).
- Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).
- Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).
- Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
- Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).
- Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer’s disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
- Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
- Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer’s disease–lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206 (2014).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
- Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
- Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
- Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413 (2020).
- Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
- Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).
