Descemet’s Stripping Only är ett experimentellt förfarande där patienter med centrala hornhinnan guttae som härrör från Fuchs Endotelial Corneal Dystrophy har Descemets membran strippat för perifera celler för att regenerera endotelskiktet. Vi presenterar ny metodik som simulerar DSO i dystrofa mänskliga hornhinnor ex vivo med accelererad läkning stimulerad av eFGF1 (NM141).
Fuchs Endotelial Corneal Dystrophy (FECD) är resultatet av dysfunktionella hornhinnans endotelceller (CEC) och behandlas för närvarande genom transplantation av hela hornhinnan eller Descemets membran. Den senaste utvecklingen inom okulär kirurgi har etablerat Descemets Stripping Only (DSO), en kirurgisk teknik där en central cirkel av guttaetät Descemets membran avlägsnas för att möjliggöra migrering av CEC till den släta stroma, vilket återställer funktion och syn till hornhinnan. Även om detta potentiella behandlingsalternativ är av stort intresse inom oftalmisk forskning, har inga framgångsrika ex vivo-modeller av DSO etablerats och kliniska data är begränsade. Detta arbete presenterar en ny sårläkningsmodell som simulerar DSO i mänskliga donatorkorneor. Med hjälp av detta tillvägagångssätt för att utvärdera effekten av den mänskligt konstruerade FGF1 (NM141) fann vi att behandlingen påskyndade läkning via stimulering av migration och spridning av CEC. Detta fynd bekräftades hos 11 par humana hornhinnor med tecken på dystrofi som rapporterats av ögonbankerna för att verifiera att dessa resultat kan replikeras hos patienter med Fuchs dystrofi, som målpopulation för DSO-proceduren.
Fuchs Endotelial Corneal Dystrophy (FECD) är en sjukdom som kännetecknas av förlorad pumpfunktion i hornhinnans endotelceller (CEC) och överdriven uppbyggnad av kollagen och andra extracellulära matrisproteiner på ytan av Descemets membran, som bildar hornhinnans guttae1. Den enda kända behandlingen för FECD är endotelial keratoplastik i varierande former, som alla medför risk för avstötning och endotelcellförlust2. Medan framsteg inom oftalmisk kirurgi har gjort det möjligt för dessa förfaranden att bli mindre invasiva med tiden, någon form av transplantation kommer med risken för avstötning och möjlighet till livstid steroidanvändning, en behandling med sina egna samtidiga biverkningar. Dessutom är den globala bristen på donatorvävnad sådan att endast en donator hornhinna är tillgänglig för varje 70 patienter i behov3. Med tanke på dessa utmaningar utforskar forskare och kliniker kirurgiska metoder som helt undviker behovet av donatorvävnad. En av dessa experimentella tekniker är Descemets Stripping Only (DSO) eller Descemetorhexis utan endotel keratoplastik (DWEK), där FECD-patienter med guttae lokaliserade till mitten av hornhinnan har en central 4 mm cirkel av Descemets membran strippad utan transplantatplacering. Avlägsnandet av guttae uppmuntrar friska perifera celler att migrera inåt och reformera endotelmonoskiktet, så småningom vända stromalt ödem och förbättra synen. Konceptet beskrevs ursprungligen i en serie fallstudier där patienter genomgick operation som komplicerades av avlägsnande av Descemets membran, men CEC-återpopulation inträffade fortfarande 4,5,6,7. Även om det finns många fördelar med denna metod är läkningsprocessen lång och inkonsekvent, eftersom vissa patienter kräver räddningstransplantation om ingen läkning ses under månaderna efter operation8. Av dessa skäl kan ett läkemedel som stimulerar snabbare migration och spridning av CEC vara fördelaktigt i återhämtningsprocessen för FECD-patienter som har genomgått DSO.
Flera nyligen genomförda studier har utvärderat ROCK-hämmare som en kompletterande behandling för patienter som genomgår DSO, och funnit att behandlade patienter återhämtade sig snabbare och hade högre centrala endotelcelltätheter (ECD) än de i DSO endast grupp 9,10,11. På grund av små provstorlekar och skillnader mellan doseringsregimer behövs dock mer data för att bättre förstå effekten av ROCK-hämmare i denna inställning.
Fibroblasttillväxtfaktorer har också visat sig stimulera regenerering av hornhinnans endotel både in vitro med bovina CEC och in vivo i katthinnan12,13. eFGF1 (NM141) är en konstruerad version av FGF-1 som innehåller flera aminosyrasubstitutioner för att stabilisera molekylen, i motsats till den inhemska FGF-1, som har en mycket kortare halveringstidpå 14,15. Vi har tidigare visat förmågan hos eFGF1 (NM141) att stimulera spridning av CEC ex vivo i kvartade humana hornhinnor16. Denna studie försökte förbättra det arbetet genom att etablera den första framgångsrika ex vivo-modellen av DSO i både normala och dystrofa hornhinnor för att avgöra om tilläggsbehandlingar som eFGF1 (NM141) påskyndar läkning i denna applikation.
Många ögonläkare har oro över att rekommendera DSO till sina patienter av två huvudskäl: 1) den långa läkningsprocessen och 2) brist på data (DSO är ett nytt koncept inom ögonkirurgi). Den forskning vi har presenterat skulle vara till stor nytta för att lindra båda dessa problem. Baserat på data från denna studie och andra har FDA godkänt en klinisk fas 2-studie där eFGF1 (NM141) kommer att administreras enligt varierande doseringsscheman till patienter som genomgår DSO17.
Metoden som beskrivs ovan modellerades efter en studie utförd av Soh et al., där hornhinnans endotelläkning utvärderades med och utan ROCK-hämmaren Y-27632 i både repade och skalade sår18. Medan Y-27632 accelererade endotelregenerering med Descemets membran fortfarande intakt, hittades ingen väsentlig läkning i avskalade sår även med behandling. Med hjälp av en liknande strippningsteknik följt av behandling med eller utan eFGF1 (NM141) överensstämde de observationer vi hittade inte med Soh och kollegor. Frånvaron av Trypan Blue-färgning i många behandlade hornhinnor vid dag 14 och närvaron av ZO-1-positiva täta korsningar inom det reformerade endotelskiktet hävdar att en intakt barriär, en del av CEC: s naturliga funktion, återställdes i både normala och dystrofa hornhinnor. Även om det inte kvantifieras i denna studie, tyder närvaron av EdU-positiva celler i och runt det avskalade området också på spridning som en läkningsmekanism, en som vi tidigare har fastställt kan stimuleras av eFGF1 (NM141) i skadade hornhinnor16. Statistisk analys visade att behandling med eFGF1 (NM141) resulterade i signifikant större läkning från DSO, i genomsnitt över dubbelt så hög som kontroll hornhinnor vid 14 dagars tidpunkt. Även om läkningsgraden varierar måttligt mellan individer – en typisk egenskap hos donatorkorneor – visar resultatens replikerbarhet över stora provstorlekar också en mycket mätbar metod. Vad vi vet finns det inga andra exempel på en ex vivo Descemets strippningsmodell i litteraturen.
Viktiga komponenter i själva protokollet som skulle vara värdefulla för andra forskare som studerar DSO är användningen av Trypan Blue för att upptäcka bar stroma och bildbehandlingstekniken som används för att mäta det färgade området. Trypan Blue används ofta vid oftalmisk kirurgi, särskilt när man arbetar med Descemets membran för att upptäcka icke-livskraftiga celler och hjälpa till att synliggöra vävnaden. Färgningstidpunkterna som ingår i detta protokoll möjliggjorde effektiv upprepad färgning utan att överexponera hornhinnor för Trypan Blue, eftersom det har visat sig vara giftigt för CEC vid höga koncentrationer19. Minskningen av färgat område under 14 dagar i alla hornhinnor, bekräftat av Alizarin Red och immunohistokemi att vara resultatet av migrerade CEC, visar en enkel och reproducerbar metod för att mäta läkning. Med hjälp av ImageJ:s färgtröskelmeny samlade flera analytiker in data med standardavvikelser konsekvent under 1 % (data visas inte). Även om alternativa program kan fungera på samma sätt, är ImageJ en programvara med öppen källkod som kan producera exakta områdesmätningar för att spåra läkning.
Det finns dock en aspekt av strippningsprotokollet som vi fann vara både nödvändig för sårskapande, men ändå hindrande för den övergripande läkningsprocessen. Att använda en skarp 30 G nål för att göra Descemets membran längs märket som lämnas av biopsistansen möjliggör skapandet av ett slätt, cirkulärt sår som noteras av kliniker för att stödja snabbare läkning10. Samtidigt är detta steg skadligt för hornhinnan, eftersom det kan skapa tårar i stromafibrerna som orsakar stromal celldöd, hindrar migrering av endotelceller över sårkanten och inducerar bildandet av knölar som resulterar i mer ihållande postoperativt ödem20. Kliniker som utför DSO använder vanligtvis en omvänd Sinskey-krok för att initiera såret, men utan något intraokulärt tryck som håller hornhinnan spänt är detta verktyg mindre effektivt i ex vivo-modellen . Ett alternativt verktyg som kan riva Descemets membran utan att skada den underliggande stroma skulle förbättra protokollet, till exempel bevattnings- och aspirationshandstycket som rekommenderas av Macsai och Shiloach10. Ytterligare experiment kommer att behövas för att avgöra om denna teknik är kompatibel med ex vivo-modellen .
En utmaning som verkar inneboende i ex vivo-modellen är den frekventa förekomsten av CEC-död i området perifert till såret, särskilt i dystrofa hornhinnor. Denna ibland dolda kvantifiering av sårområdet, eftersom noggrannheten hos färgtröskelverktyget blir mer begränsad eftersom det färgade området sträcker sig bortom hornhinnans centrum där dess krökning resulterar i ojämn ljusfördelning. Dessa variabla mätningar inträffade dock främst vid tidigare tidpunkter innan perifer färgning gradvis avtog när skadade CEC rensades och angränsande celler sträckte sig, migrerade eller förökade sig för att ersätta dem. Vid den sista 14-dagarspunkten hade det färgade området lokaliserats tillbaka till mitten av hornhinnan, och alla bilder var mätbara. En liknande observation gjordes med jämförbar frekvens av Soh et al., där fem av 14 normala hornhinnor presenterade vad de kallade “Premature Culture Failure” (PCF) tidigt under kulturperioden18. Även om skadan vände sig med tiden i våra hornhinnor och ändå var permanent i deras fall, kan detta tillskrivas det faktum att deras metod krävde sårning av ett större område av hornhinnan. Observationen av mer utbredd perifer Trypan-färgning i dystrofa hornhinnor kan indikera att dystrofa hornhinnor är mer mottagliga för endotelcelldöd än friska hornhinnor. Även om den exakta orsaken till denna celldöd ännu inte har klarlagts, tror vi att det är osannolikt att denna fråga kommer att vara relevant för mänskliga hornhinnor in vivo. Skador på det perifera endotelet har inte rapporterats i några kliniska fallstudier av DSO såvitt vi vet, vilket tyder på att detta fenomen är unikt för donatorhornhinnor odlade ex vivo 6,8,10,11,21. Bortsett från två fall där endast kontrollhornhinnor färgades, parades alla observationer av perifer färgning, så det är osannolikt att orsaken var exponering för eFGF1 (NM141). Det är emellertid möjligt att behandlingen i dessa fall kan ha gett en skyddande effekt mot den skada som annars skulle ha framkallat perifer färgning i båda hornhinnorna. Ytterligare undersökning av denna hypotes behövs.
En annan begränsning för denna metod är att köpa donatorhornhinnor som är representativa för den FECD-fenotyp som DSO är avsedd för. Donator hornhinnor av något slag är knappa, därav behovet av en operation som undviker användning av donatorvävnad. För våra ändamål är de enda hornhinnorna som finns tillgängliga de som avvisas från transplantation av olika skäl. Ögonbanker klassificerar vidare dessa hornhinnor som normala eller dystrofa baserat på kriterier inklusive förekomst av guttae, låg eller o mätbar ECD och oregelbunden CEC-morfologi. Att bekräfta en dystrofisk diagnos innan vävnad accepteras från en ögonbank är också nästan omöjligt, eftersom de flesta givares medicinska historia inte inkluderar tidigare okulär historia och den enda informationen som tillhandahålls är ECD-värdet, teknikerns anteckningar och i vissa fall en representativ spekulär bild. De dystrofa hornhinnorna som erhölls för denna studie visade inte sammanflytande centrala guttae vid konfokalmikroskopi utförd efter att odlingsperioden var klar, vilket tyder på att de kan representera “tidiga” stadier av FECD. Vi förväntar oss inte att detta kommer att ha någon betydande inverkan på konsekvenserna av studien, eftersom syftet med DSO är att avlägsna sammanflytande områden av guttae, så att friska perifera celler kan migrera inåt.
Denna metod ger en mycket tillämplig och reproducerbar teknik för att utvärdera medel som kan påverka CEC-spridning och migration. Modellen har flera funktioner som gör den mer fysiologiskt relevant än in vitro-modeller som involverar odlade CEC, även när den sås på humant hornhinnevävnadstransplantat 22,23,24. För det första är de CEC som ska stimuleras i ett monolager exakt som de existerar i patientens öga och migrerar över hornhinnans stroma som de skulle göra efter klinisk DSO. Stroma i fråga kommer från samma patient som CEC, vilket styr för potentiella FECD-relaterade stromaskillnader. Det finns inget behov av att explantera, dissociera och expandera kulturer i CEC med tillhörande utmaningar och potential för endotel till mesenkymal övergång (EnMT) under odlingsprocessen. Det beskrivna protokollet är i sig mycket likt det kliniska DSO-förfarandet. Även om den kringgår kultur- och expansionsstegen, har denna metod begränsningen att studietiden begränsas av hornhinnesvullnad, eftersom epitelskiktet inte upprätthålls. Detta hindrar oss från att undersöka morfologin hos CEC: er som har migrerat för att täcka det avskalade området, vilket gör det oklart om de så småningom kommer att ordna om till en sexkantig matris i denna modell. har utvecklat en potentiell lösning med sin aktiva lagringsmaskin (ASM), en anordning som visat sig hålla hornhinnor i odling i upp till 3 månader med betydligt mindre ödem än hornhinnor som upprätthålls i traditionell organkultur25. En sådan anordning kan vara till hjälp för att replikera och utöka detta arbete.
Denna modell har potentiell nytta när det gäller att testa andra sårläkningsterapier (t.ex. ROCK-hämmare), utvärdera modifieringar av kirurgisk teknik och jämföra läkning över olika givarpopulationer eller sjukdomsstadier. Vi hoppas att denna forskning, i kombination med kliniska prövningsdata när den kommer ut, uppmuntrar kliniker att överväga DSO som ett värdefullt behandlingsalternativ för sina berättigade FECD-patienter.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering för detta arbete stöddes av Trefoil Therapeutics och NIH NCATS TRND CRADA #2016-04. Författarna vill tacka Tony Wong för histopatologiska råd och tjänster, Nikon Imaging Center vid UC San Diego för användning av deras konfokala mikroskop och Drs. Natalie Afshari och Marian Macsai för deras råd om kirurgisk teknik. Dessutom uttrycker författarna sin tacksamhet till givarna av ögon och ögonbankerna för att de gav hornhinnor.
0.2µm sterile 1000 mL filter units | VWR | 10040-440 | |
0.2µm sterile 250 mL filter units | VWR | 10040-464 | |
0.2µm sterile 500 mL filter units | VWR | 10040-436 | |
10mL syringe Luer-Lok Tip | Becton Dickinson | 302995 | |
12 well tissue culture treated plate | Corning | 3513 | |
15 mL conical Tubes | VWR | 89039-668 | |
16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
2mL aspirating pipette | VWR | 414004-265 | |
310 direct heat CO2 incubator | Forma Scientific | 13-998-082 | Set to 37°C, 6% CO2 |
50 mL conical tubes | VWR | 89039-660 | |
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) | Thermo Scientific | C10337 | |
5mL, 10mL, 25mL and 50mL serological pipettes | VWR | 89130-896, -898, -900, -902 | |
6 well tissue culture treated plate | Corning | 3516 | |
70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
Alexa Fluor 488 azide | Thermo Scientific | A10266 | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | |
Analytical balance | Sartorious | R200D | |
Antibiotic & Antimycotic 100x (anti-anti) | Thermo Scientific | 15240-062 | |
Anti-magnetic stainless steel forceps | Excelta | 7-SA | |
Bottle top dispenser | Ward's Science | 470134-946 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | |
Calcium chloride (CaCl) | Amresco | 1B1110-500G | |
Chex-all II sterilzation pouches | Propperman | 24008 | |
Cirpofloxacin hydrochloride | Alfa Aesar | J61970 | |
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4) | Sigma | 469130-50g | |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ1270 | |
Dry vacuum pump | Welch | 2019B-01 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | A31606-01 | |
Frosted micro slides | VWR | 48311-703 | |
Galaxy miniStar microcentrifuge | VWR | C1413, VWR | |
Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific | A32727 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Haemo-Sol detergent | Haemo-Sol International LLC | 026-050 | |
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Thermo Scientific | H3570 | |
Hot plate/stirrer | Corning | PC-320 | |
Human corneas | Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift, and Georgia Eye Bank | NA | |
Hydrochloric acid (HCl) | BDH | BDH7204 | |
ImageJ | National Institute of Health | Version 1.52a | |
Infinity 3s microscopy camera | Lumenera | 1URCAP2 | |
Infinity analyze software | Lumenera | Version 6.5.5 | |
Insulin transferrin selenium (ITS) | Corning | 41400-045 | |
Iris scissors, 11 cm | World Precision Instruments | 501264-G | |
L- Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | |
Manual single channel pipet | Rainin | 17014-392, -391, -382 | |
Needle PrecisionGlide 30G | Becton Dickinson | 305106 | |
N-Met141 TTHX1114 | Biopharmaceutical Development Program | NA | |
Opti-Mem I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM) | Thermo Scientific | 51985-034 | |
Orion Star A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA211 | |
Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
Potassium chloride (KCl) | BDH | BDH9258-500G | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | VWR | 0781-500G | |
Powerpette plus pipet controller | VWR | 75856-456 | |
Precision water bath 188 | Precision Scientific Incorporated | WB05 | Set to 37°C |
Purifier Class II model biosafety cabinet | Labconco | 36213043726 | |
Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363212 | |
Scalpel size 22 stainless steel | Sklar | 446479 | |
Sodium chloride (NaCl) | VWR | 2041-2.5K | |
Sodium hosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | 0404-1KG | |
Standard shaker | VWR | 89032-092 | |
Standard solid refrigerator | VWR | 10820-402 | Set to 4°C |
Sterilmatic autoclave | Market Forge | STM-EL | |
Syringe filters | VWR | 28145-477 | |
Test tube rocker | Thermo Scientific | M48725Q | |
Tru-Punch disposable biopsy punch, 4 mm | Sklar | 96-1146 | |
Trypan Blue | Thermo Scientific | 15250-061 | |
Tween-20 | Sigma | P7949-100mL | |
Vibrance antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories Inc. | H-1800 | |
VistaVision cover glasses, no. 1 | VWR | 16004-098 | |
Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12) | Thermo Scientific | 33-9100 |