Culturas Primárias de Astrócitos de Rato e Microglia e Seu Uso no Estudo da Esclerose Lateral Amiotrófica

Summary

Apresentamos aqui um protocolo sobre como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglias de córtices de ratos para imagens de vídeo de lapso de tempo de Ca²⁺ intracelular para pesquisa sobre fisiopatologia da esclerose lateral amiotrófica no modelo de rato hSOD1^G93A .

Abstract

Este protocolo demonstra como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglia a partir dos córtices de ratos Sprague Dawley e como usar essas células com a finalidade de estudar a fisiopatologia da esclerose lateral amiotrófica (ELA) no modelo hSOD1^G93A de ratos. Primeiro, o protocolo mostra como isolar e cultivar astrócitos e micróglias de córtices de ratos pós-natais e, em seguida, como caracterizar e testar a pureza dessas culturas por imunocitoquímica usando o marcador de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de astrócitos e o marcador microglial da molécula adaptadora de ligação ao cálcio ionizado 1 (Iba1). Na próxima etapa, são descritos métodos para o carregamento de corantes (Fluo 4-AM sensível ao cálcio) de células cultivadas e as gravações de alterações de Ca²⁺ em experimentos de imagem de vídeo em células vivas.

Os exemplos de gravações de vídeo consistem em: (1) casos de imagem de Ca²⁺ de astrócitos cultivados agudamente expostos à imunoglobulina G (IgG) isolados de pacientes com ELA, mostrando uma resposta característica e específica em comparação com a resposta ao ATP, conforme demonstrado no mesmo experimento. Exemplos também mostram um aumento transitório mais pronunciado na concentração intracelular de cálcio evocada pela ELA IgG em astrócitos hSOD1^G93A em comparação com controles não transgênicos; (2) Imagem Ca 2+ de astrócitos cultivados durante uma depleção dos estoques de cálcio pela thapsigargina (Thg), um inibidor não competitivo do retículo endoplasmático Ca 2+ ATPase, seguido pela entrada de cálcio operada em armazém provocada pela adição de cálcio na solução de registro, o que demonstra a diferença entre a operação de armazenamento de Ca²⁺ em hSOD1^G93A e em astrócitos não transgênicos; (3) Imagens de Ca 2+ da micróglia cultivada mostraram predominantemente uma falta de resposta à IgG da ELA, enquanto a aplicação de ATP provocou uma alteração de Ca²⁺. Este artigo também enfatiza possíveis ressalvas e advertências em relação à densidade celular crítica e pureza das culturas, escolhendo a concentração correta do corante Ca²⁺ e das técnicas de carregamento de corantes.

Introduction

As técnicas de cultura de células deram origem a inúmeros avanços em diversos campos da neurofisiologia celular na saúde e na doença. Particularmente, as culturas de células primárias, recém-isoladas do tecido neuronal de um animal de laboratório, permitem que o experimentador estude de perto o comportamento de diversas células em diferentes meios bioquímicos e configurações fisiológicas. O uso de diferentes indicadores fisiológicos fluorescentes, como os corantes sensíveis ao Ca^2+, em combinação com a microscopia de vídeo de lapso de tempo, fornece uma melhor visão dos processos biofísicos e bioquímicos celulares em tempo real.

A ELA é uma doença neurodegenerativa devastadora que afeta os neurônios motores superiores e inferiores¹. A doença tem uma patogênese complexa do tipo familiar, mas principalmente da forma esporádica (90% dos casos)². Sabe-se que mecanismos autônomos não celulares contribuem para a fisiopatologia da ELA, principalmente devido ao papel essencial das células gliais³. A ELA também é bem caracterizada como uma doença neuroinflamatória com envolvimento de fatores humorais e celulares de inflamação.

A imunoglobulina G é amplamente utilizada como marcador molecular na ELA e em outras doenças neurodegenerativas. Estudar o nível sérico desse marcador pode indicar a presença e o estágio da neuroinflamação na doença ^4,5,6, enquanto sua presença no líquido cefalorraquidiano pode indicar uma violação da barreira hematoencefálica 7. IgGs também foram identificadas como depósitos nos neurônios motores da medula espinhal de pacientes com ELA⁷. No entanto, essa abordagem tem mostrado algumas inconsistências na correlação do nível de IgGs com o estágio e as características da doença⁶.

A IgG isolada dos soros de pacientes com ELA (ALS IgG) pode induzir uma resposta de cálcio em astrócitos ingênuos⁸ e liberação de glutamato em neurônios, apontando para um efeito excitotóxico – uma característica da patologia da ELA⁹. No entanto, estudos sobre o modelo de camundongo HSA hSOD1^G93A (contendo múltiplas cópias da mutação humana^{SOD1 10}) mostraram uma série de marcadores de estresse oxidativo em células neurogliais cultivadas 11, tecidos 12,13,14 ou animais vivos ¹³. Ressalta-se que os astrócitos cultivados a partir do modelo de ratos com ELA foram mais propensos ao estresse oxidativo induzido pelo peróxido do que a astroglia de companheiros de ninhada não transgênicos¹¹.

As células microgliais em cultura são afetadas pela ELA IgG de forma menos aparente. Ou seja, uma linhagem celular microglial BV-2 apresentou um aumento no sinal de marcadores fluorescentes de estresse oxidativo em resposta à aplicação de apenas 4/11 amostras de pacientes com ELA IgG¹⁵. Sabe-se que a micróglia participa de muitas patologias neuroinflamatórias, aumentando o estresse oxidativo e a fase de progressão tardia no mecanismo autônomo não celular da ELA^16,17. No entanto, os dados com IgGs da ELA indicaram que essas células podem não ser tão reativas quanto os astrócitos a esses fatores humorais da inflamação da ELA. Vários estudos têm sido realizados com astrócitos primários de modelos murinos de ELA, não apenas em filhotes, mas também em animais sintomáticos, seja no cérebro ou na medula espinhal 18,19,20,21. Isso também é verdade para culturas primárias microgliais, embora em menor grau do que os astrócitos e principalmente de regiões cerebrais no estágio embrionário^22,23,24.

Usamos imagens de vídeo de lapso de tempo de Ca²⁺ em células em cultura principalmente como um meio de seguir os transientes intracelulares deste íon como um marcador fisiológico de excitotoxicidade. Assim, pela caracterização biofísica desses transientes (amplitude, área sob transiente, tempo de subida, frequência) o pesquisador pode obter parâmetros diagnósticos experimentais a partir de diversos modelos celulares de neurodegeneração. Esta técnica oferece, portanto, uma vantagem de uma avaliação fisiológica quantitativa de IgGs como biomarcadores da doença. Há um grande corpo de literatura sobre o papel das IgGs e Ca²⁺ na indução da ELA. A maioria desses estudos foi realizada induzindo ELA injetando IgGs de pacientes em animais experimentais 25,26,27,28,29^, que então mostraram elevação intracelular de Ca ²⁺ e deposições de IgG. Uma linha de estudos explorou o efeito da ELA IgGs na sinapse motora in vitro^30,31,32. No contexto acima, a técnica aqui apresentada coloca o foco nas células gliais como atores importantes no mecanismo autônomo não celular da ELA e quantifica sua potencial resposta excitotóxica às IgGs como fatores humorais da neuroinflamação. Essa abordagem pode ter uma aplicação mais ampla no teste de outros fatores humorais como soros inteiros, LCR ou citocinas em diferentes sistemas de cultura celular e em modelos celulares de inflamação geral.

Este artigo descreve como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglia a partir dos córtices de ratos Sprague Dawley e como usar essas células para estudar a fisiopatologia da ELA com IgG derivada de soros de pacientes. Os protocolos são detalhados para o carregamento de corante de células cultivadas (Figura 1) e as gravações de alterações de Ca²⁺ em experimentos de imagem de vídeo de lapso de tempo. Exemplos de gravações de vídeo mostrarão como as células gliais reagem à ALS IgG em comparação com o ATP, este último ativando os receptores de membrana purinérgicos. Mostrado pela primeira vez é um exemplo de como os astrócitos isolados do cérebro de ratos hSOD1^G93A ALS reagem com uma resposta mais pronunciada de Ca 2+ à ALS IgG em comparação com controles não transgênicos e como relacionar esse processo com as diferenças na operação de armazenamento de Ca²⁺. Também é mostrado um exemplo de imagem de cálcio em células microgliais agudamente desafiadas com ALS IgG, com apenas uma resposta modesta de cálcio intracelular.

Protocol

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretivas da UE sobre a proteção de animais para fins científicos e com permissão da Comissão de Ética da Faculdade de Biologia da Universidade de Belgrado (número de aprovação EK-BF-2016/08). Em relação ao material do paciente (soros para IgGs), este foi coletado para exame clínico de rotina com o consentimento informado do paciente, de acordo com o Código de Ética da Associação Médica Mundial (Declaração de Helsinque) para experimentos envolvend…

Representative Results

Caracterização de diferentes tipos de células gliais em culturaGeralmente leva de 15 a 21 dias para produzir astrócitos para experimentos, enquanto as células microgliais levam de 10 a 15 dias para crescer. A imunocoloração foi realizada para avaliar a pureza celular da cultura. A Figura 1 mostra a expressão da dupla marcação do marcador astrocítico GFAP e do marcador microglial Iba1 nas respectivas culturas. Sabe-se que a imagem de…

Discussion

Este trabalho apresenta o método de cultura celular primária como uma ferramenta rápida e “dentro do orçamento” para o estudo de diferentes aspectos da fisiologia celular (pato), como a ELA, no modelo hSOD1^G93A de ratos. A técnica é, portanto, adequada para estudos no nível de célula única que podem ser extrapolados e investigados em um nível mais alto de organização (ou seja, em fatias de tecido ou em um animal vivo). A cultura celular como técnica, no entanto, tem algumas ressalvas. É mais impo…

Materials

15 mL tube	Sarstedt, Germany	62 554 502
2 mL tube	Sarstedt, Germany	72.691
21 G needle	Nipro, Japan	HN-2138-ET
23 G needle	Nipro, Japan	HN-2338-ET
5 mL syringe	Nipro, Japan	SY3-5SC-EC
6 mm circular glass coverslip	Menzel Glasser, Germany	630-2113
60 mm Petri dish	ThermoFisher Sientific, USA	130181
ATP	Sigma-Aldrich, Germany	A9062
AxioObserver A1	Carl Zeiss, Germany
Bovine serum albumine	Sigma-Aldrich, Germany	B6917
Calcium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	2110
Centrifuge	Eppendorf, Germany
DAPI	Sigma-Aldrich, Germany	10236276001
D-glucose	Sigma-Aldrich, Germany	158968
DMEM	Sigma-Aldrich, Germany	D5648
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody	Invitrogen, USA	A-21447
Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody	Invitrogen, USA	A-21202
EDTA	Sigma-Aldrich, Germany	EDS-100G
EGTA	Sigma-Aldrich, Germany	E4378
”evolve”-EM 512 Digital Camera System	Photometrics, USA
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10500064
Fiji ImageJ Software	Open source under the GNU General Public Licence
FITC filter set	Chroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AM	Molecular Probes, USA	F14201
Goat anti-Iba1	Fujifilm Wako Chemicals, USA	011-27991
HEPES	Biowest, France	P5455
HighSpeed Solution Exchange System	ALA Scientific Instruments, USA
Incubator	Memmert GmbH + Co. KG, Germany
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	M2393
Matlab software	Math Works, USA
Mouse anti-GFAP	Merck Millipore, USA	MAB360
Mowiol 40-88	Sigma-Aldrich, Germany	324590
Normal donkey serum	Sigma-Aldrich, Germany	D9663
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, Germany	158127
Penicilin and Streptomycin	ThermoFisher Sientific, USA	15140122
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich, Germany	P5899
Potassium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	P5405
Potassium dihydrogen phosphate	Carlo Erba Reagents, Spain	471686
Shaker DELFIA PlateShake	PerkinElmer Life Sciencies, USA
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, Germany	S3817
Sodium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	S5886
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Carl ROTH GmbH	X987.2
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich, Germany	P5280
Thapsigargine	Tocris Bioscience, UK	1138
Triton X – 100	Sigma-Aldrich, Germany	T8787
Trypsin	Sigma-Aldrich, Germany	T4799
Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520	Wescor, ELITechGroup Inc., USA
ViiFluor Imaging System	Visitron System Gmbh, Germany
VisiChrome Polychromator System	Visitron System Gmbh, Germany
VisiView high performance setup	Visitron System Gmbh, Germany
Xenon Short Arc lamp	Ushio, Japan