Vi presenterar här ett protokoll om hur man förbereder primära kulturer av gliaceller, astrocyter och mikroglia från råttkortiker för time-lapse-videoavbildning av intracellulär Ca2+ för forskning om patofysiologi av amyotrofisk lateralskleros i hSOD1G93A-råttmodellen .
Detta protokoll visar hur man förbereder primära kulturer av gliaceller, astrocyter och mikroglia från kortikerna hos Sprague Dawley-råttor och hur man använder dessa celler för att studera patofysiologin för amyotrofisk lateralskleros (ALS) i råtta hSOD1G93A-modellen . Först visar protokollet hur man isolerar och odlar astrocyter och mikroglia från postnatala råttkortiker, och sedan hur man karakteriserar och testar dessa kulturer för renhet genom immunocytokemi med hjälp av glialfibrillärt surt protein (GFAP) markör för astrocyter och den joniserade kalciumbindande adaptermolekylen 1 (Iba1) mikroglial markör. I nästa steg beskrivs metoder för färgämnesbelastning (kalciumkänslig Fluo 4-AM) av odlade celler och inspelningar av Ca2+ förändringar i videoavbildningsexperiment på levande celler.
Exemplen på videoinspelningar består av: (1) fall av Ca2+ avbildning av odlade astrocyter akut exponerade för immunglobulin G (IgG) isolerade från ALS-patienter, vilket visar ett karakteristiskt och specifikt svar jämfört med svaret på ATP som visats i samma experiment. Exempel visar också en mer uttalad övergående ökning av intracellulär kalciumkoncentration som framkallas av ALS IgG i hSOD1G93A-astrocyter jämfört med icke-transgena kontroller; (2) Ca 2+ avbildning av odlade astrocyter under en utarmning av kalciumförråd av thapsigargin (Thg), en icke-konkurrenskraftig hämmare av endoplasmatisk retikulum Ca 2+ ATPas, följt av butiksdriven kalciumpost som framkallas genom tillsats av kalcium i registreringslösningen, vilket visar skillnaden mellan Ca2+ butiksdrift i hSOD1G93A och i icke-transgena astrocyter; (3) Ca 2+ avbildning av den odlade mikroglia som huvudsakligen visar brist på svar på ALS IgG, medan ATP-applikationen framkallade en Ca2+ förändring. Detta papper betonar också möjliga försiktighetsåtgärder och försiktighetsåtgärder angående kritisk celldensitet och renhet hos kulturer, genom att välja rätt koncentration av Ca2+ färgämne och färgladdningstekniker.
Cellodlingstekniker har gett upphov till många framsteg inom olika områden av cellulär neurofysiologi inom hälsa och sjukdom. Särskilt primära cellkulturer, nyligen isolerade från neuronvävnaden hos ett laboratoriedjur, tillåter experimentören att noggrant studera beteendet hos olika celler i olika biokemiska medier och fysiologiska inställningar. Att använda olika fluorescerande fysiologiska indikatorer som Ca2+-känsliga färgämnen i kombination med time-lapse-videomikroskopi ger bättre inblick i de cellulära biofysiska och biokemiska processerna i realtid.
ALS är en förödande neurodegenerativ sjukdom som drabbar övre och nedre motorneuroner1. Sjukdomen har en komplex patogenes av familjär typ men mestadels av sporadisk form (90% av fallen)2. Det är välkänt att icke-cellautonoma mekanismer bidrar till ALS-patofysiologi, främst på grund av glialcellernas väsentliga roll3. ALS karakteriseras också väl som en neuroinflammatorisk sjukdom med involvering av humorala och cellulära faktorer av inflammation.
Immunoglobulin G används ofta som en molekylär markör vid ALS och andra neurodegenerativa sjukdomar. Att studera serumnivån för denna markör kan indikera närvaron och stadiet av neuroinflammation i sjukdomen 4,5,6, medan dess närvaro i cerebrospinalvätskan kan indikera ett brott mot blodhjärnbarriären7. IgG identifierades också som avlagringar i ryggmärgsmotorneuronerna hos ALS-patienter7. Ändå har detta tillvägagångssätt visat vissa inkonsekvenser i korrelationen mellan nivån av IgG och sjukdomsstadiet och egenskaperna hos sjukdomen6.
IgG isolerad från serum hos ALS-patienter (ALS IgG) kan inducera ett kalciumsvar i naiva astrocyter8 och glutamatfrisättning i nervceller, vilket pekar på en excitotoxisk effekt – ett kännetecken för ALS-patologi9. Studier på hSOD1G93A ALS-råttmodellen (innehållande flera kopior av den humana SOD1-mutationen10) visade dock ett antal markörer för oxidativ stress i odlade neurogliaceller11, vävnader 12,13,14 eller levande djur 13. Det är anmärkningsvärt att astrocyterna som odlades från ALS-råttmodellen var mer benägna att oxidativ stress inducerad av peroxid än astroglia från icke-transgena kullkamrater11.
Mikrogliaceller i odling påverkas av ALS IgG på ett mindre uppenbart sätt. En BV-2 mikroglial cellinje visade nämligen en ökning av signalen från fluorescerande markörer för oxidativ stress som svar på appliceringen av endast 4/11 ALS IgG-patientprover15. Det är välkänt att mikroglia deltar i många neuroinflammatoriska patologier, vilket bidrar till oxidativ stress och sen progressionsfas i den icke-cellautonoma mekanismen för ALS16,17. Ändå indikerade data med ALS IgGs att dessa celler kanske inte är lika reaktiva som astrocyter mot dessa humorala faktorer av ALS-inflammation. Flera studier har utförts med primära astrocyter från ALS murinmodeller, inte bara hos ungar utan också hos symtomatiska djur, antingen på hjärnan eller på ryggmärgen 18,19,20,21. Detta gäller även för mikrogliala primära kulturer, men i mindre utsträckning än astrocyter och mestadels från hjärnregioner i embryonalstadiet22,23,24.
Vi använder time-lapse videoavbildning av Ca2+ på celler i odling främst som ett sätt att följa intracellulära transienter av denna jon som en fysiologisk markör för excitotoxicitet. Genom biofysisk karakterisering av dessa transienter (amplitud, område under övergående, stigtid, frekvens) kan forskaren således erhålla experimentella diagnostiska parametrar från olika cellulära modeller av neurodegeneration. Denna teknik erbjuder således en fördel av en kvantitativ fysiologisk bedömning av IgG som sjukdomsbiomarkörer. Det finns en stor mängd litteratur om IgGs och Ca2+ roll i induktionen av ALS. De flesta av dessa studier utfördes genom att inducera ALS genom att injicera patientens IgG i försöksdjur 25,26,27,28,29, som sedan visade intracellulär Ca 2+ förhöjning och IgG-deposition. En rad studier undersökte effekten av ALS IgG på motorsynapsen in vitro30,31,32. I ovanstående sammanhang sätter tekniken som presenteras här fokus på gliacellerna som viktiga aktörer i den icke-cellautonoma mekanismen för ALS och kvantifierar deras potentiella excitotoxiska svar på IgG som humorala faktorer för neuroinflammation. Detta tillvägagångssätt kan ha en bredare tillämpning vid testning av andra humorala faktorer som hela sera, CSF eller cytokiner i olika cellodlingssystem och i cellulära modeller av allmän inflammation.
Detta dokument beskriver hur man förbereder primära kulturer av gliaceller, astrocyter och mikroglia från kortikerna hos Sprague Dawley-råttor och hur man ytterligare använder dessa celler för att studera ALS-patofysiologi med patientens sera-härledda IgG. Protokollen är detaljerade för färgämnesbelastning av odlade celler (figur 1) och inspelningar av Ca2+ förändringar i time-lapse videoavbildningsexperiment. Exempel på videoinspelningar visar hur gliaceller reagerar på ALS IgG jämfört med ATP, det senare aktiverar purinerga membranreceptorer. För första gången visas ett exempel på hur astrocyter isolerade från hSOD1G93A ALS-råtthjärnan reagerar med ett mer uttalat Ca 2+ svar på ALS IgG jämfört med icke-transgena kontroller och hur man relaterar denna process till skillnaderna i Ca2+ butiksdrift. Dessutom visas ett exempel på kalciumavbildning i mikrogliaceller som akut utmanas med ALS IgG, med endast ett blygsamt svar av intracellulärt kalcium.
Detta dokument presenterar metoden för primär cellodling som ett snabbt och “på budgeten” -verktyg för att studera olika aspekter av cell (pato) fysiologi såsom ALS i råtta hSOD1G93A-modellen . Tekniken är således lämplig för studier på encellsnivå som kan extrapoleras och undersökas vidare på en högre organisationsnivå (dvs. i vävnadsskivor eller i ett levande djur). Cellodling som teknik har dock några försiktighetsåtgärder. Det är mest kritiskt att göra hjärnvävnadsisolering och dis…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ministeriet för utbildningsvetenskap och teknisk utveckling Republiken Serbien kontrakt nr 451-03-9/2021-14 / 200178, FENS – NENS Education and Training Cluster-projektet “Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation” och EC H2020 MSCA RISE-bidrag #778405. Vi tackar Marija Adžić och Mina Perić för att de levererade immunhistokemibilderna och Danijela Bataveljić för hjälp med pappersskrivning.
15 mL tube | Sarstedt, Germany | 62 554 502 | |
2 mL tube | Sarstedt, Germany | 72.691 | |
21 G needle | Nipro, Japan | HN-2138-ET | |
23 G needle | Nipro, Japan | HN-2338-ET | |
5 mL syringe | Nipro, Japan | SY3-5SC-EC | |
6 mm circular glass coverslip | Menzel Glasser, Germany | 630-2113 | |
60 mm Petri dish | ThermoFisher Sientific, USA | 130181 | |
ATP | Sigma-Aldrich, Germany | A9062 | |
AxioObserver A1 | Carl Zeiss, Germany | ||
Bovine serum albumine | Sigma-Aldrich, Germany | B6917 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 2110 | |
Centrifuge | Eppendorf, Germany | ||
DAPI | Sigma-Aldrich, Germany | 10236276001 | |
D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 158968 | |
DMEM | Sigma-Aldrich, Germany | D5648 | |
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21447 | |
Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21202 | |
EDTA | Sigma-Aldrich, Germany | EDS-100G | |
EGTA | Sigma-Aldrich, Germany | E4378 | |
”evolve”-EM 512 Digital Camera System | Photometrics, USA | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10500064 | |
Fiji ImageJ Software | Open source under the GNU General Public Licence | ||
FITC filter set | Chroma Technology Inc., USA | ||
Fluo-4 AM | Molecular Probes, USA | F14201 | |
Goat anti-Iba1 | Fujifilm Wako Chemicals, USA | 011-27991 | |
HEPES | Biowest, France | P5455 | |
HighSpeed Solution Exchange System | ALA Scientific Instruments, USA | ||
Incubator | Memmert GmbH + Co. KG, Germany | ||
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | M2393 | |
Matlab software | Math Works, USA | ||
Mouse anti-GFAP | Merck Millipore, USA | MAB360 | |
Mowiol 40-88 | Sigma-Aldrich, Germany | 324590 | |
Normal donkey serum | Sigma-Aldrich, Germany | D9663 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, Germany | 158127 | |
Penicilin and Streptomycin | ThermoFisher Sientific, USA | 15140122 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich, Germany | P5899 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | P5405 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Carlo Erba Reagents, Spain | 471686 | |
Shaker DELFIA PlateShake | PerkinElmer Life Sciencies, USA | ||
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Germany | S3817 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S5886 | |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Carl ROTH GmbH | X987.2 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich, Germany | P5280 | |
Thapsigargine | Tocris Bioscience, UK | 1138 | |
Triton X – 100 | Sigma-Aldrich, Germany | T8787 | |
Trypsin | Sigma-Aldrich, Germany | T4799 | |
Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520 | Wescor, ELITechGroup Inc., USA | ||
ViiFluor Imaging System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
VisiChrome Polychromator System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
VisiView high performance setup | Visitron System Gmbh, Germany | ||
Xenon Short Arc lamp | Ushio, Japan |