1. Forberedelse af indsamling Identificer et sted at undersøge Caenorhabditis nematoder.BEMÆRK: I de fleste tempererede regioner kan C. elegans og C. briggsae let isoleres fra menneskerelaterede levesteder som landbrugsmarker eller land- og byhaver1. I subtropiske og tropiske regioner kan C. briggsae, C. elegans og C. tropicalis alle findes i de menneskerelaterede levesteder, der er anført ovenfor, nogle gange i nærheden af hinanden. C. elegans synes dog at foretrække køligere og tørrere levesteder end de andre arter i tropiske levesteder7,8. Hver af arterne kan også isoleres fra vilde levesteder, der ikke er forbundet med mennesker, men disse levesteder udtages sjældnere. Opret et Fulcrum-projekt for at organisere indsamlings- og isolationsdata med de mobile dataindsamlingsapplikationer. Opret en konto hos Fulcrum online ved hjælp af en gratis uddannelsesaftale16. Føj applikationen Nematode Field Sampling til en Fulcrum-konto ved at klikke på knappen ADD APP17. Føj applikationen Nematode Isolation til en konto ved at klikke på knappen TILFØJ APP18.BEMÆRK: Det anbefales, at hver tur til et sted organiseres som sit indsamlingsprojekt ved hjælp af navngivningskonventionen ‘YearMonthLocation’, f.eks. 2020FebruaryAustralia. Føj brugere til Fulcrum-kontoen for at give dem adgang til indsamlingsprojektet. Sørg for, at hver bruger downloader Fulcrum-mobilapplikationen for at deltage i projektet. Udskriv et sæt QR-kodeetiketter for at spore samlingerne (C-etiketter) og nematodeisolationerne (S-etiketter) med mobilapplikationen. Fastgør C-etiketterne til plastikposer med lynlås, rul de mærkede poser i grupper på 25, og pakk dem ind med et gummibånd til pakning. Opbevar sættet med S-etiketter til brug i laboratoriet.BEMÆRK: I hele denne protokol er samlingerne (substrater fra marken) indeholdt i poser eller på plader og er mærket med C-etiketter. De isolerede nematoder er mærket med S-etiketter. C-etiketterne bruges til at identificere unikke samlinger, og S-etiketterne bruges til at identificere unikke nematodeisolater. Disse to typer etiketter bruges til at skabe forbindelsen mellem en bestemt samling (C-label) og nematoderne isoleret fra denne samling (S-labels) i Fulcrum-databasen. Udskriv dobbelt så mange S-labels som C-labels til et indsamlingsprojekt, fordi der i gennemsnit isoleres to nematoder pr. samling. Flere S-labels kan udskrives senere, hvis det er nødvendigt. 2.500 unikke C-etiketter (supplerende fil 1) og 5.000 unikke S-etiketter (supplerende fil 2) findes i tillægget. Forbered 10 cm NGMA plader til samlinger og 3,5 cm NGMA plader til isolering af nematoder. Lav en plade på 10 cm og mindst to plader på 3,5 cm pr. kollektion21. Disse plader er podet med Escherichia coli stamme OP50 efter etablerede protokoller. Opbevar pladerne inden brug ved 4 °C i højst 1 måned. 2. Indsamling i marken BEMÆRK: Caenorhabditis nematoder isoleres oftest fra rådnende vegetabilsk materiale, herunder frugt, nødder, frø, bælg, blomster, stilke, vegetabilsk kuld og kompost1,5,6,8. De bedste substrater er rådne og næsten uigenkendelige som frugter eller blomster; undgå underlag, der er for tørre eller våde (figur 1). Underlag indsamles mest effektivt fra marken ved at arbejde parvis. Personen med det berøringsfri infrarøde termometer vælger et substrat til indsamling og indsamler prøven, mens deres partner bruger Nematode Field Sampling-applikationen i Fulcrum til at registrere indsamlingsdataene. Parret af samlere gentager denne proces, indtil det ønskede antal prøver er indsamlet. Listen over materialer, der kræves til feltarbejde, findes i (Supplerende tabel 1). Åbn Fulcrum-mobilappen, vælg Nematode Field Sampling i rullemenuen. Tryk på + for at starte en ny post i projektet (figur 2A). Tag et billede af substratet. Klik på feltet øverst i midten for at vælge det korrekte indsamlingsprojekt, der er lavet i trin 1.2 (figur 2B). Tryk på feltet C-label nederst i samlingsposten, og vælg Scan, når prompten vises. Scan stregkoden på indsamlingsposen ved hjælp af kameraet på mobilenheden, og tryk derefter på OK øverst til højre på skærmen. Tryk på feltet Substrat , og vælg en substrattype i rullemenuen. Tilføj noter om substratet ved at trykke på feltet Substrater og manuelt indtaste noter. Vælg et landskab i rullemenuen. Vælg det landskab, der bedst repræsenterer prøveudtagningsstedet. Vælg en himmelvisning. Når du vælger himmelvisning, skal du beskrive himmelsynligheden på prøveudtagningsstedet (f.eks. En fuld himmeludsigt uden blokeret udsigt fra træer eller andre strukturer = fuld). Mål substratets overfladetemperatur ved hjælp af berøringsfrit termometer, og registrer værdien i substrattemperaturfeltet.BEMÆRK: Hold det berøringsfri termometer højst 14 tommer fra underlaget, mens du registrerer temperaturen. Mål omgivelsestemperaturen og fugtigheden med den håndholdte enhed, og registrer disse data i de rigtige felter.BEMÆRK: Kontroller, at omgivelsestemperatur- og fugtighedsanordningen ikke er i venteposition. Måleenheden ændres, når knappen frigives. Opbevar enheden i en udvendig lomme for at undgå uregelmæssige aflæsninger. Gem posten i Fulcrum ved at trykke på Gem øverst til venstre på skærmen. Saml omkring en spiseskefuld af substratet uden pinde eller andre hårde stykker ved at vende opsamlingsposen for at bruge den som en “handske” til at samle substratet op og derefter forsegle posen. Læg et papirhåndklæde i posen, hvis prøven er særlig fugtig.BEMÆRK: I varme klimaer skal du placere poserne i bløde kølere med køligere pakker for at holde samlingerne kølige. Når alle prøverne er indsamlet for dagen, skal du rengøre indsamlingsudstyret, tage batterier ud af sonder, genoplade batterier, frysepakker igen. Synkroniser Fulcrum-indsamlingsdataene ved at trykke på knappen Synkroniser øverst til venstre i programmet Nematode Field Sampling .BEMÆRK: Uploads kan tage flere minutter uden en stærk mobilforbindelse, så det kan være bedst at vente på WiFi-adgang. Dataene forbliver på mobile enheder og synkroniseres med skyen. Send prøverne til en hjemmeinstitution ved at placere dem i en forsendelseskasse natten over. Minimer den tid, prøverne udsættes for temperaturer under 11 °C eller over 25 °C, ved at sende pakker på dage, hvor godset transporteres.BEMÆRK: De fleste forsendelsesfaciliteter sender ikke gods natten over i weekenden på fjerntliggende steder. 3. Udregulering af feltsamlinger i laboratoriet BEMÆRK: Dette afsnit beskriver, hvordan du organiserer overførslen af prøver fra mærkede indsamlingsposer til mærkede plader. Prøverne kan ankomme fra en forsendelse natten over eller direkte fra marken. Modtag forsendelsen af samlinger og inspicér for ødelagte poser eller andre tegn på skade. Hvis poser er brudt, skal du kassere materialet og rengøre de ubrudte opsamlingsposer med 70% ethanol; undgå C-etiketten på posen med ethanolen, da det vil misfarve etiketten og gøre den vanskelig at læse. For hver lynlåspose skal du notere C-etiketten på posen og fastgøre en matchende C-etiket på låget på en 10 cm plade plettet med OP50-bakterier.BEMÆRK: De mærkede 10 cm plader kaldes ‘C-plader’ for resten af protokollen. Den nemmeste måde at organisere prøverne på er at placere opsamlingsposerne på en laboratoriebænk med den matchende C-plade ovenpå (figur 3). For hver samling overføres ca. en spiseskefuld prøve fra opsamlingsposen til C-pladen ved hjælp af en ren plastske. Tilsæt prøven omkring bakterieplænen i halvmåne eller ringform, dæk ikke bakterieplænen helt (figur 4).BEMÆRK: Hold spisesedlen ren ved at placere den i et bægerglas med 95% ethanol, når den ikke er i brug. Brug et papirhåndklæde til at tørre spiseskefulden, inden du overfører yderligere prøver. Registrer det tidspunkt, hvor samlingerne blev overført fra opsamlingsposer til C-plader, og opbevar C-pladerne ved stuetemperatur (RT) i mindst 24 timer, før man forsøger at isolere nematoder i afsnit 4. 4. Isolering af nematoder fra samlinger Åbn Fulcrum-applikationen på den mobile enhed, og vælg Nematode Isolation i programmenuen (figur 5A). Lav en ny isolationspost ved at trykke på ikonet + nederst til højre (figur 5B). På det nye skærmbillede med isolationsposten skal du bekræfte det korrekte indsamlingsprojekt ved at markere det projektnavn, der vises i feltet øverst i midten. Hvis det forkerte projekt vises, skal du trykke på projektnavnet for at skifte til det rigtige projekt (figur 5C). Tryk på knappen Vælg under feltet C-etiket for at finde den C-etiket, der er knyttet til den prøve, hvorfra nematoder isoleres (figur 5D). Tryk på ikonet Søg , og tryk derefter på ikonet Scan for at scanne C-label QR-koden på C-pladen med enhedens kamera. Når QR-koden er scannet, vises en C-label-post i feltet C-label . Tryk på kameraikonet i feltet Fotos for at åbne enhedens kamera, og brug det til at tage et foto af prøven på C-pladen med QR-koden synlig (figur 5E). Tryk på Udført for at vende tilbage til isolationsskærmen.BEMÆRK: Disse isolationsoptagelsesbilleder kan bruges til at udforske specifikke egenskaber ved substratet på et senere tidspunkt. Brug et dissekerende mikroskop til at lede efter nematoder på C-pladen. Tryk på feltet Orme på prøve for at registrere tilstedeværelsen af nematoder på prøven (figur 5F). Tryk på Ja , hvis nematoder er til stede på C-pladen, og tryk på Nej, hvis der ikke er nogen nematoder til stede. Tryk på Spor, hvis der kun er nematodespor til stede. Hvis der ikke er nematoder til stede, parafilm C-pladen og bortskaffe den i en biofarebeholder.BEMÆRK: Vend C-pladen over papiraffaldsbeholderen, og tryk forsigtigt på bagsiden af pladen for at løsne alle de udtagne substrater. Dette trin gør det lettere at finde og isolere nematoder, der kan være under substratet på C-pladen. Hvis nematoder er til stede, skal du isolere op til fem nematoder fra C-pladen. For at isolere en nematode skal du overføre en nematode fra C-pladen til en S-plade ved hjælp af en platintrådplukker. Isoler sunde, gravide voksne, hvis det er muligt. Isoler dog andre faser, hvis voksne ikke findes.BEMÆRK: Efter isolering vil op til fem S-plader hver have en enkelt nematode på sig. Opbevar disse S-plader med isolerede nematoder fra den samme C-plade organiseret sammen i en pæn stak væk fra andre S-plader, indtil de er indgået i Fulcrum. Tryk på feltet S-mærkede plader for at indtaste den eller de S-plader, der bruges til denne isolering. Tryk på + nederst til højre. Tryk på S-label , og klik derefter på Scan for at åbne enhedens kamera. Brug enhedens kamera til at scanne S-label QR-koden på S-pladen.BEMÆRK: Sørg for, at S-label-koden stemmer overens med koden på pladen. Hvis det stemmer overens, skal du trykke på Udført. Hvis det ikke gør det, skal du trykke på Annuller og genscanne, indtil det matcher, og klik derefter på Udført. Nogle gange scannes QR-koder for nærliggende plader ved et uheld. Når du har indtastet hver S-plade, skal du gemme posten med knappen Gem øverst til højre. Posten går tabt, hvis den ikke gemmes. Tryk på + nederst til højre for at tilføje flere S-mærkede plader, hvis det er nødvendigt, indtil alle nematoder isoleret fra C-pladen er indtastet. Når du har tilføjet alle de S-mærkede plader til isolationsposten, skal du trykke på knappen < øverst til venstre for at gå tilbage til isolationspostskærmen.BEMÆRK: Hvis du vil annullere en isolationspost, fordi fejl ikke kan løses, skal du klikke på Annuller øverst til venstre. Dette trin åbner en dialogboks, der spørger, om posten kan kasseres uden at gemme. Hvis det ønskes, skal du klikke på Ja, kassér. Tryk på knappen Gem øverst til højre, når isolationsposten har tilføjet alle oplysninger korrekt. Derefter parafilm S-pladerne med isolerede nematoder og læg dem til side i et område, der er udpeget til at holde S-plader med nematoder. Parafilm C-pladen og kassér den i biofarebeholderen. Tryk på ikonet Synkroniser for at uploade alle data til Fulcrum. Sorter alle S-pladerne i alfanumerisk rækkefølge, og læg derefter S-pladerne i papkasser. Sørg for, at S-pladerne er med lågsiden nedad og parafilmet. Stabl op til fire S-plader i én position i kassen, og mærk papkassen med projektets navn, dato, klokkeslæt og et unikt kassenummer. Opbevar de mærkede kasser på RT. Disse isolater vil blive kontrolleret for spredning ved 48 timer og igen ved 168 timer, hvis det er nødvendigt. 5. Eksport af S-plader fra Fulcrum BEMÆRK: Dette afsnit beskriver, hvordan du eksporterer S-etiketter, der bruges i isolationsprocessen, fra Fulcrum-projektdatabasen. Disse S-etiketter vil blive brugt til at spore spredningsområder, mens de identificeres ved sekvensidentitet i afsnit 6-9. Log ind på Fulcrum-webstedet, og vælg applikationen Nematode Isolation . Klik på Eksportør fra venstre side af skærmen. Klik for at vælge det ønskede projekt, og marker afkrydsningsfeltet Nematodeisolering . Klik på Næste for at downloade en .zip fil, der indeholder filen “nematode_isolation_s_labeled_plates.csv”. Åbn filen ‘nematode_isolation_s_labeled_plates.csv’, og sorter den efter kolonnen ‘S-label’ i stigende rækkefølge (den mindste S-etiket vil være øverst). Vælg alle S-etiketterne, og kopier dem fra regnearket. Naviger til den vilde isolat genotyping skabelon google sheet (wild_isolate_genotyping_template) ved hjælp af en webbrowser19. Lav en kopi af dette Google-ark ved at højreklikke på fanen Genoypingskabelon og derefter vælge indstillingen Kopier til nyt regneark . Vælg Åbn regneark for at se det nye Google-ark. Navngiv dette nye ark med omdrejningspunktets projektnavn efterfulgt af ‘wild_isolate_genotyping’, f.eks. ‘2020FebruaryAustralia_wild_isolate_genotyping’.BEMÆRK: Dette ark kaldes ‘genolysningsarket’ i resten af protokollen. Indsæt de S-etiketter, der er kopieret fra kolonnen »nematode_isolation_s_labeled_plates.csv« »s_label«, i kolonnen med genotypeark med titlen »s_label«. Tjek kolonnen ‘s_label_repeat_error’ for ‘1’er. En værdi på ‘1’ i denne kolonne betyder, at S-etiketten duplikeres et eller andet sted på genotypearket. Hvis der opdages dobbeltarbejde, skal du undersøge og rette dem, før du går videre. Udfyld kolonnen »isolation_box_number« for alle S-etiketter. 6. Kontroller for spredning på S-plader Kontroller for dyr, der formerer sig på S-plader 48 timer efter isolering (brug dato og klokkeslæt for sidste isolering på kassen fra trin 4.11 til at guide timing).BEMÆRK: Prolifererende nematoder er kendetegnet ved afkom på S-pladen. Hvis en S-plade breder sig, skal du indtaste »1« i kolonnen proliferation_48 på genotypearket og derefter flytte S-pladen til en rubrik mærket »48 timers spredning, rubrik 1«. Anbring maksimalt 88 S-plader i en spredningskasse, og begynd derefter at fylde en ny kasse mærket ’48 timers spredning, boks 2′. Sørg for, at S-etiketterne er organiseret i alfanumerisk rækkefølge i 48 timers spredningsbokse.BEMÆRK: Bortskaf ikke de ikke-spredende S-plader; disse plader vil blive kontrolleret igen ved 168 timer efter isolation. Hvis det ønskes, konsolideres disse S-plader i numerisk rækkefølge i kasser mærket ’48 timer ikke-spredning, boks X’, men husk at registrere, hvornår 168 timers afkrydsningsfeltet skal ske på den nye boks. Efter at have identificeret alle de spredende S-etiketter ved 48 timer, gå videre til afsnit 7 for S-plader med spredning ved 48 timer. Kontroller de S-plader, der ikke spredte sig ved 48 timer efter isolation igen ved 168 timer efter isolation. Hvis en S-plade nu breder sig, skal du indtaste ‘1’ i kolonnen proliferation_168 på genotypearket og derefter flytte S-pladen til en kasse mærket ‘168 h proliferation, box 1’. Anbring maksimalt 88 S-plader i en spredningsboks, og begynd derefter at fylde en ny kasse mærket ‘168 timers spredning, boks 2’. Sørg for at organisere S-etiketter i alfanumerisk rækkefølge i 168 timers spredningsbokse. Kassér S-pladerne, der ikke har spredning efter 168 timer. Gå videre til afsnit 7 for S-plader med spredning ved 168 timer. 7. Lysis af isofikvindelige linjer BEMÆRK: Dette trin bruger datafilterværktøjet i Google Sheets til at hjælpe med at udskrive lysisregneark til S-pladerne i spredningsboksene. Formålet med lysis-regnearkene er at give personalet de korrekte positioner til S-etiketter i lysisbåndsrør ved bænken. Åbn genotypearket for det ønskede projekt, og vælg alle celler ved at skrive Cmd + A. Klik på Data > Opret et filter for at tilføje en filterknap til hver kolonneoverskrift. Brug knapperne Filter til kun at få vist de S-plader, der skal genotypes. Hvis f.eks. alle S-plader med spredning ved 48 timer skal lyseres: Klik på knappen Filter i kolonnen ‘proliferation_48’, og vælg ‘1’. Når det genotypende Google-ark er blevet filtreret, skal du gennemgå listen over S-etiketter, der vises, for at sikre, at de er de S-etiketter, der skal udskrives på regnearket. I kolonnen ‘strip_tube_number’ i det genotypende Google-ark skal du indtaste et unikt nummer hver 11. række. Indtast striprørnumrene for et projekt i successiv rækkefølge, der starter ved 1 og aldrig duplikeres. Indtast 2 til 12 for hvert strimmelrørnummer i ‘strip_tube_position’.BEMÆRK: Brug 12-rørs strimmelrør til lysis. Den første position (strip_tube_position 1) vil være kontrol, men kontrollerne føjes ikke til lysisregnearkene (kun de strip_tube_positions tilføjes, 2-12). På tidspunktet for lysis vil den positive kontrolstamme ‘N2’ blive tilføjet til position 1 i hvert lige nummereret strimmelrør som en positiv kontrol. Der tilføjes ingen orme til position 1 i hvert ulige nummereret strimmelrør som en negativ kontrol. Filtrer det genotypende google-ark yderligere for kun at inkludere S-etiketterne i en spredningsboks, der skal lyseres, og vælg derefter kolonnerne ‘s_label’ til ‘lysis_notes’. Udskriv et lysisregneark for hver spredningsboks, der skal lyseres. Klik på rullemenuen i feltet Udskriv, og vælg Valgte celler. Klik på Næste øverst til højre, og brug derefter dialogen til at udskrive lysisregnearket til spredningsboksen. Gentag trin 7.3-7.5 for at udskrive et lysikregneark for hver spredningsboks.BEMÆRK: Hver spredningsboks rummer op til 88 S-plader, hvilket svarer til otte 12-brønds strimmelrør. Forbered 12-brønds strimmelrør til alle de prøver, der vil blive lyseret. Mærk et strimmelrør med et unikt ‘strip_tube_number’, der er tildelt i lysisregnearket. Denne etiket skal skrives på hættestrimlen og strimmelrøret for at undgå forvirring, hvis de er adskilt. EVEN-striprørene har en positiv kontrol (N2-orme) i position 1. ODD-striprørene har en negativ kontrol (ingen orme) i position 1. Der fyldes nok lysisbuffer (100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8,2, 5 mM MgCl2, 0,9% IGEPAL, 0,9% Tween 20, 0,02% gelatine med proteinase K tilsat til en endelig koncentration på 0,4 mg/ml) til alle prøverne og tilsættes 5% ekstra for pipettefejl. Skaler efter behov.BEMÆRK: Lysisbufferen fremstilles bedst ved at kombinere alle ingredienser undtagen proteinase K og fryse i 10-50 ml alikvoter ved -20 °C. Optø aliquots og opbevar dem ved 4 °C inden brug; Umiddelbart før brug tilsættes proteinase K og blandes grundigt. Opbevar lysisbufferen på is, mens du arbejder. Arranger S-pladerne til et bestemt strimmelrør i rækkefølge ved hjælp af det trykte lysisregneark som vejledning. Fjern et strimmelrør, og tilsæt 8 μL lysisbuffer til hver hætte med en gentagen pipettor. Tilføj lysisbufferen til en strimmel hætter ad gangen, fordi lysisbufferen vil fordampe, hvis den efterlades ved RT og afdækkes. Pluk 3-5 dyr fra kildepladerne (S-plade eller N2-lagerplade til positiv kontrol) i de relevante hættepositioner, der er angivet på lysisregnearket. Optag noter til enhver S-plade med færre end 5 orme plukket til lysis i den lysis_notes del af lysisregnearket. Når du har lagt nematoder i hver position af strimmelrøret, skal du placere hættestrimlen tilbage på strimmelrøret. Match den markerede hætte (position 1) med det markerede rør (position 1). Når det er lukket, centrifugeres strimmelrøret kort, indtil nematoderne er i bunden af røret. Anbring strimlen i -80 °C fryseren, indtil den er helt frosset (mindst 10 min.). Gentag trin 7.9 til 7.11, indtil alle strimler har nematoder tilsat til lysis. Organiser rørstrimlerne i numerisk rækkefølge. Fjern sæt af striprør, og kør lysisprogrammet i en termocyklist: 1 time ved 60 °C, 15 min ved 95 °C, hold ved 12 °C. Når lysisprogrammet er færdigt, skal du spinde prøverne ned ved 300 x g i 15 s ved RT og opbevare lysaterne ved -80 ° C i op til 1 uge. Organiser rørstrimlerne i numerisk rækkefølge ved hjælp af 96-brønds pladeholdere og inkluder en etiket med et spredningsboksnummer, strimmelrørnummerområde, dato og forskerens initialer. Opdater genolysningsarkkolonnerne ‘lysis_date’ og ‘lysis_notes’ med oplysninger fra lysisregnearket. 8. PCR af SSU- og ITS2-sekvenser BEMÆRK: Dette afsnit indeholder instruktioner om, hvordan du udfører to separate PCR’er for hver lyseret S-plade. Det første primersæt forstærker et 500-bp fragment af 18S rDNA lille underenhedsgen (SSU); oECA1271 = fremadgående primer TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = omvendt primer CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA 12. Denne PCR bruges til at kontrollere kvaliteten af skabelon-DNA’et. PCR forstærker SSU-regionen for næsten alle nematodearter. Hvis SSU PCR ikke forstærker, tyder dette resultat på, at lysiskvaliteten er dårlig, og lysen skal gentages for denne S-plade. Det andet primersæt forstærker et 2.000 bp fragment af det interne transskriberede afstandsområde mellem 5.8S og 28S rDNA-generne (ITS2); oECA1687 = fremadrettet primer CTGCGTTACTTACCACGAATTGCARAC, oECA202 = omvendt primer GCGGTATTTGCTACTACCAYYAMGATCTGC3. ITS2 PCR-produktet er Sanger-sekventeret, og sekvensen bruges til at identificere nematoder i Caenorhabditis-slægten til artsniveauet efter sekvenslighed. Brug filtreringsværktøjet i genotypearket til kun at få vist de S-etiketter, der skal bruges til PCR. Opdater pcr_plate_number, og pcr_well kolonner i genodypingarket. For at forhindre nedbrydning af lysismateriale køres SSU og ITS2 PCR’er på samme tid. Brug de samme pcr_plate_number til ITS2- og SSU PCR’erne, selvom disse er separate reaktioner i separate plader. De vil blive skelnet med »SSU«- eller »ITS2«-mærker. Tildel en pcr_plate_number til otte eller færre strimmelrør (et strimmelrør pr. Række af PCR-pladen med 96 brønde, arrangeret i stigende rækkefølge, f.eks. laveste strimmelrørnummer ovenpå). Tildel derefter en pcr_plate_well til hver S-etiket i strimmelrørene.BEMÆRK: Strimmelrørene er arrangeret i stigende rækkefølge med det laveste strimmelrørnummer tildelt række A og det højeste tal i række H. Position 1 af alle strimmelrør er tildelt kolonne 1. Derfor vil striprør nummer 1, position 1 blive tildelt PCR-plade nummer 1, godt A01. Mærk 96-brønds PCR-plade (r) for at rumme de prøver, der skal bruges til PCR. Mærk hver PCR-plade med følgende oplysninger: projektnavn, PCR-type, PCR-pladenummer og dato for PCR (f.eks. 2020FebruaryAustralia_SSU_1_20200304). Mærk også pladen med strimmelrørnumrene, der vil blive indlæst i hver række. Fjern lysismaterialet fra fryseren -80 °C, og optø strimmelrørene, der indeholder lysismaterialet, på is. Mens lysismaterialet optøes, skal du forberede ITS2- og SSU-masterblandinger i separate rør på is. SSU- og ITS2 PCR-opskrifterne findes i supplerende tabel 2.BEMÆRK: Forbered 100 reaktioner af PCR-masterblanding for hver 96-brønds plade for at muliggøre pipetteringsfejl. Brug en 15 ml eller 50 ml konisk til at holde masterblandingen, hvis der skal anvendes store mængder. Vortex masteren blandes forsigtigt, indtil Taq fordeles i hele blandingen. Når de er blandet, blandes 38 μL af masteren til de relevante brønde på PCR-pladerne på is. Brug sterile v-bundtrug til engangsbrug og en 12-brønds flerkanalspipette til at overføre masterblandingen til PCR-pladerne. Spin ned de optøede lysisstrimmelrør for at fjerne lysismateriale fra hætterne. Fjern forsigtigt lågene på alle strimmelrørene, der skal lægges i den første PCR-plade. Brug en flerkanalspipette med lavt volumen (enten 12-brønd eller 8-brønd) til at tilføje 2 μL lysat til den relevante brønd i PCR-pladen. Rør forsigtigt lysatet op og ned en gang, før du fjerner 2 μL.BEMÆRK: Kontroller tipene for at sikre, at de indeholder lysis før overførslen. Husk at ændre tip mellem rækker eller kolonner. Dæk PCR-pladen med PCR-klæbende folie og brug en rulle til at skabe en tæt tætning. Når folien er påført, drejes PCR-pladerne kortvarigt ned i en centrifuge. Opbevar pladen på is, indtil den er klar til at køre i termocyklisten. Kør PCR’erne med det relevante termocyklistprogram. Se supplerende tabel 2 for at få flere oplysninger om SSU- og ITS2 PCR-programmerne. Gentag trin 8.4- 8.8, indtil alle PCR’er er kørt. Mens PCR-reaktionerne kører, hæld en 100 ml 1,5% agarosegel. Hver gel vil indeholde prøver eller en enkelt PCR-plade. Der tilsættes 1,5 g agarose til en kolbe på 500 ml, derefter tilsættes 100 ml 1x TAE-buffer (supplerende tabel 3), og der hvirvles rundt for at blande. Mikrobølgeovn til opløsning og afkøling af gelen. Når opløsningen er afkølet, tilsættes 5 μL 10 mg/ml ethidiumbromidopløsning og blandes for at kombinere. Hæld opløsningen i en støbebakke med fire kamme med 25 brønde, så gelen kan rumme 96 prøver plus en stige for hver række i gelen.BEMÆRK: Ethidiumbromid er et potent mutagen. Ved håndtering af ethidiumbromid skal du bruge en laboratoriefrakke, kemikalieresistente handsker og kemiske sikkerhedsbriller. Lige før PCR er færdig, tilsættes 6x lastfarvestof til et engangstrug og bruges en flerkanalspipette til at tilføje 2 μL 6x lastfarvestof til hver brønd i en ny 96-brønds PCR-plade. Denne plade vil blive brugt til at indlæse prøverne i gelen. Lav nok af disse plader til at rumme alle prøverne. Når PCR’erne er færdige, skal du fjerne PCR-pladerne og kortvarigt centrifugere dem ved 300 x g i 15 s ved RT. Opbevar PCR-pladerne på is, indtil PCR-produkterne kan løbe tør på en gel. For at køre produkterne ud på en gel skal du bruge en 12-brønds flerkanalspipette til at tilsætte 5 μL af hver prøve til den passende brønd på en 96-brønds plade indeholdende 2 μL 6x lastfarvestof. Læg derefter 6 μL af denne blanding i hver brønd af en nyligt støbt gel. Læg 6 μL på 1 KB plus stige i den første brønd i hver række af gelen.BEMÆRK: For at fylde gelens brønde kan det være nødvendigt at blande række A og række B fra PCR-pladen i gelens første række. For at undgå forvirring skal du registrere gel_number og gel_position i genotekstningsarket for hver PCR-prøve. Anbring et nyt folielåg på den resterende PCR i pladen/pladerne, og opbevar dem ved 4 °C. Disse reaktionsprodukter vil blive anvendt til sekventering i trin 9. Kør PCR-produkterne ud på gelen ved 120 V i 20 min. Billede den gel og optegnelse, som S-etiketter giver ITS2- og/eller SSU PCR-produkter, i kolonnerne »pcr_product_its2« og »prc_product_ssu« på genotikarket. Marker tilstedeværelsen af et band med et ‘1’; markér et ‘0’ for intet band. 9. Identifikation af nematoder med Sanger-sekventering og sekvens BLAST BEMÆRK: Dette afsnit indeholder instruktioner til sekventering af ITS2-ampliconerne fra S-etiketterne, tilpasning af disse sekvenser til National Center for Biotechnology Information (NCBI) database ved hjælp af BLAST-algoritmen og analyse af BLAST-resultaterne for at identificere nematoderne på S-pladerne. For hver prøve, der er ITS2-positiv, skal du bruge det resterende ITS2 PCR-produkt til Sanger-sekventering ved hjælp af den fremadrettede primer oECA306 (CACTTTCAAGCAACCCGAC). Sørg for, at sekventeringsoutputfilerne let kan knyttes til en S-etiket ved at registrere kolonnerne ‘sequencing_plate’ og ‘sequencing_well’ for hver S-etiket i genotekroneringen. Hent .seq-outputfilerne for hver S-etiket fra sekventeringsplatformen. Arranger .seq-filerne for et projekt i en enkelt mappe med .seq-filer for hver batch af sekventering, der er placeret i undermapper. Åbn kommandolinjegrænsefladeværktøjet, og naviger til den øverste mappe, der indeholder .seq-filerne, ved at indtaste kommandoen: cd . Hvis den ikke allerede findes, skal du oprette en flettet FASTA for alle .seq-filerne ved at indtaste følgende kommando: for dir i */; gør cd $dir; for fil i *.seq; ekko “>”$file; kat $file; udført >>.. /all_seqs.fa; cd..; færdig.BEMÆRK: Denne kode opretter en flettet FASTA-fil med navnet ‘all_seqs.fa’ fra alle .seq-filerne i projektmappen. Denne fil kan bruges i NCBI online nukleotid BLAST værktøj til hurtigt at justere ITS2 sekvensen af hver S-label til NCBI’s sekvens database. I en webbrowser skal du navigere til NBCI BLAST-webstedet20 og klikke på knappen Vælg fil . Vælg den all_seqs.fa-fil, der netop blev oprettet, og klik derefter på knappen Noget lignende sekvenser (BLASTn). Klik på BLAST-knappen nederst på siden for at starte BLAST-søgningen. Opdater genotekstningsarket med BLAST-resultaterne for hver S-etiket. Brug filterværktøjet til at gøre opdatering af genotype-Google-arket lettere. Klik på Data > Opret et filter for at tilføje en filterknap til hver kolonneoverskrift. Filtrer kolonnen sequencing_plate for at vælge de sekventeringsplader, der skal opdateres med BLAST-resultater. Brug rullemenuen på NCBI BLAST-resultatsiden til at kontrollere resultaterne for hver S-plade ITS2-sekvens (figur 6). Kontroller, om der ikke er nogen BLAST-hits. Et sekvens-id på rullelisten med præfikset * har ingen eksplosionshits. For disse S-etiketter skal du indtaste ‘no hit ‘ i kolonnen manual_blast_notes på genotypearket. Tjek for en mulig ny Caenorhabditis art. Klik på linket på det øverste hit for at visualisere justeringen (figur 6). Hvis det øverste hit er (1) en Caenorhabditis-art , (2) justeringen indeholder mere end fem uoverensstemmelser i midten af sekvensen, og (3) forespørgselsdækningen er større end 50%, antyder dette resultat, at isolatet kan være en ny Caenorhabditis-art (figur 7). For disse S-plader indtastes arten af den øverste BLAST i kolonnen ‘species_id’, indtaster en 1 i kolonnen ‘possible_new_caeno_sp’ og ‘mulig ny Caeno sp.’ i kolonnen ‘manual_blast_notes’ sammen med procentidentitet (f.eks. ‘mulig ny Caeno sp. 89% identitet’). For S-pladesekvenser, der BLAST til en Caenorhabditis-art , skal du indtaste det fulde slægts- og artsnavn på det øverste BLAST-hit i kolonnen ‘species_id’. For eksempel ‘Caenorhabditis elegans’. For S-pladesekvenser, der BLAST til en ikke-Caenorhabditis-art , skal du kun indtaste slægten af det øverste BLAST-hit efterfulgt af ‘sp.’ i kolonnen ‘species_id’. Denne notation betyder, at isolatet er en ukendt art inden for den navngivne slægt. For eksempel ‘Oscheius sp.’.BEMÆRK: ITS2-sekvensen kan ikke anvendes til pålideligt at identificere isolater på artsniveau uden for Caenorhabditis-slægten3,13. Indtast 1 i kolonnen »make_strain_name« på genotypearket, hvis »species_id« = »Caenorhabditis elegans«, »Caenorhabditis briggsae« eller »Caenorhabditis tropicalis« ELLER »possible_new_caeno_sp« = 1. Navngiv stammerne med unikke navne efter Caenorhabditis nomenklaturkonventioner, dvs. en unik laboratoriebetegnelse bestående af 2-3 store bogstaver efterfulgt af et tal for hver unik stamme23. Indtast stammenavnene i kolonnen “strain_name”. Efter at stammer er navngivet, kan de kryokonserveres ved hjælp af etablerede protokoller 24. 10. Behandling af indsamlingsdata med easyFulcrum-pakken i R BEMÆRK: Dette trin beskriver, hvordan du forbinder indsamlingsdataene (C-etiketter) og nematodeisoleringsdataene (S-etiketter) sammen ved hjælp af easyFulcrum R-pakken. Softwaren indeholder funktioner, der yderligere vil forbinde Fulcrum-dataene med genotypedataene fra genotypearket, så S-label-artsidentiteter og stammenavne er organiseret i en enkelt dataramme. Opret en ny mappe, der er navngivet til kollektionsprojektet. Arranger mappestrukturen i mappen, så den matcher de krav, der er beskrevet i R-pakken easyFulcrum15. Naviger til Fulcrum-webstedet, og log ind. Eksporter de rå projektdata fra Fulcrum-databasen ved hjælp af Fulcrum-webstedets dataeksportværktøj til venstre, og markér følgende afkrydsningsfelter: projekt, inkluder fotos, inkluder GPS-data, feltprøveudtagning og isolering.BEMÆRK: Fulcrum-dataene for projektet eksporteres som fem kommaseparerede værdifiler (.csv). De komplette projektdata samles i en enkelt dataramme ved hjælp af easyFulcrum-pakken i R. Flyt de fem .csv filer, der eksporteres fra Fulcrum, til den projektmappe, der blev oprettet i trin 10.1 som beskrevet i easyFulcrum-vignetten21. Åbn en Rstudio-session, og installer easyfulcrum-pakken i R ved at indtaste følgende kommandoer i R-konsollen ‘install.packages(“devtools”)’ og ‘devtools::install_github(“AndersenLab/easyfulcrum”)’. Åbn et nyt R-script, og følg anvisningerne i easyfulcrum-vignetten for at behandle indsamlingsdataene21.