Denne undersøgelse bruger flowcytometri og to forskellige gating strategier på isolerede perfuserede mus hjerne choroid plexuser; denne protokol identificerer de vigtigste immuncelleundergrupper, der befolker denne hjernestruktur.
Hjernen betragtes ikke længere som et organ, der fungerer isoleret; akkumulerende beviser tyder på, at ændringer i det perifere immunsystem indirekte kan forme hjernens funktion. Ved grænsefladen mellem hjernen og den systemiske cirkulation er choroid plexuses (CP), som udgør blod-cerebrospinalvæskebarrieren, blevet fremhævet som et centralt sted for periferi-til-hjerne-kommunikation. CP producerer cerebrospinalvæsken, neurotrofiske faktorer og signalmolekyler, der kan forme hjernens homeostase. CP er også en aktiv immunologisk niche. I modsætning til hjerneparenchymen, som hovedsageligt er befolket af mikroglia under fysiologiske forhold, rekapitulerer heterogeniteten af CP-immunceller den mangfoldighed, der findes i andre perifere organer. CP-immuncellediversiteten og aktiviteten ændres med aldring, stress og sygdom og modulerer aktiviteten af CP-epitelet og derved indirekte former hjernens funktion. Målet med denne protokol er at isolere murin CP og identificere ca. 90% af de vigtigste immunundergrupper, der befolker dem. Denne metode er et værktøj til at karakterisere CP-immunceller og forstå deres funktion i orkestrering af periferi-til-hjerne-kommunikation. Den foreslåede protokol kan hjælpe med at dechiffrere, hvordan CP-immunceller indirekte modulerer hjernens funktion i sundhed og på tværs af forskellige sygdomstilstande.
Siden opdagelsen af blod-hjerne-barrieren af Paul Erhlich i slutningen af det 19. århundrede er hjernen blevet betragtet som næsten adskilt fra de andre organer og blodbanen. Alligevel har dette sidste årti set fremkomsten af konceptet om, at hjernens funktion er formet af forskellige biologiske faktorer, såsom tarmmikrobiota og systemiske immunceller og signaler1,2,3,4. Parallelt er andre hjernegrænser såsom meninges og choroid plexuses (CP) blevet identificeret som grænseflader af aktiv immun-hjerne kryds tale snarere end inerte barrierevæv5,6,7,8.
CP udgør blod-cerebrospinalvæskebarrieren, en af grænserne, der adskiller hjernen og periferien. De er placeret i hver af de fire ventrikler i hjernen, dvs. den tredje, den fjerde og begge laterale ventrikler, og støder op til områder involveret i neurogenese, såsom hippocampus subventrikulære zone og subgranulære zone3. Strukturelt består CP af et netværk af fenestrated blodkapillærer omgivet af et monolag af epitelceller, som er forbundet med tætte og klæbende kryds9,10. Store fysiologiske roller af CP-epitelet involverer produktion af cerebrospinalvæske, som skyller hjernen fra affaldsmetabolitter og proteinaggregater, og produktion og kontrolleret blod-til-hjerne-passage af forskellige signalmolekyler, herunder hormoner og neurotrofiske faktorer11,12,13. Udskilte molekyler fra CP former hjernens aktivitet, dvs. ved at modulere neurogenese og mikroglial funktion14,15,16,17,18,19, hvilket gør CP afgørende for hjernens homeostase. CP deltager også i forskellige immunaktiviteter; mens den vigtigste immuncelletype i hjerneparenkymet under ikke-patologiske tilstande er microglia, er mangfoldigheden af CP-immuncellepopulationer lige så bred som i perifere organer3,7, hvilket tyder på, at forskellige kanaler for immunregulering og signalering er på arbejde ved CP.
Rummet mellem endotel- og epitelcellerne, CP stroma, er hovedsageligt befolket af grænsesammensatte makrofager (BAM), som udtrykker proinflammatoriske cytokiner og molekyler relateret til antigenpræsentation som reaktion på inflammatoriske signaler3. En anden undertype af makrofager, Kolmers epiplexusceller, er til stede på den apikale overflade af CP-epitelet20. CP stroma er også en niche for dendritiske celler, B-celler, mastceller, basofiler, neutrofiler, medfødte lymfoide celler og T-celler, som for det meste er effektorhukommelse T-celler, der er i stand til at genkende antigener i centralnervesystemet7,21,22,23,24. Derudover ændres sammensætningen og aktiviteten af immuncellepopulationer ved CP ved systemisk eller hjerneforstyrrelse, for eksempel under aldring10,14,15,21,25, mikrobiotaforstyrrelse7, stress26 og sygdom27,28. Især blev disse ændringer foreslået til indirekte at forme hjernens funktion, dvs. et skift af CP CD4 + T-celler mod Th2-inflammation forekommer i hjernens aldring og udløser immunsignalering fra CP, der kan forme aldringsrelateret kognitiv tilbagegang14,15,21,25,29 . Belysning af CP-immuncellernes egenskaber ville således være afgørende for bedre at forstå deres regulerende funktion på CP-epitelfysiologi og sekretion og derved dechiffrere deres indirekte indvirkning på hjernens funktion under sunde og sygdomsforhold.
CP er små strukturer, der kun indeholder få immunceller. Deres isolering kræver mikrodissektion efter et indledende trin af perfusion; immunceller i blodbanen ville ellers udgøre store forurenende stoffer. Denne protokol har til formål at karakterisere myeloid- og T-celledelmængderne af CP ved hjælp af flowcytometri. Denne metode identificerer ca. 90% af de immuncellepopulationer, der komponerer muse-CP under ikke-inflammatoriske tilstande, i overensstemmelse med nyligt offentliggjorte værker ved hjælp af andre metoder til at dissekere immun-CP-heterogenitet7,10,28. Denne protokol kunne anvendes til at karakterisere ændringer i CP-immuncellerummet med sygdom og andre eksperimentelle paradigmer in vivo.
Undersøgelser, der sigter mod at forstå de immunologiske bidrag til hjernens homeostase og sygdom, har hovedsageligt fokuseret på celler, der befinder sig i hjernens parenchyma, idet de forsømmer hjernegrænser som CP, som ikke desto mindre er afgørende bidragydere til hjernens funktion2,3. Analysen af immuncellepopulationer ved CP er udfordrende på grund af den lille størrelse af CP, lavt antal bosiddende immunceller og kompliceret adgang til dette væv. …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Institut Pasteur Animalerie Centrale og CB-UTechS-facilitetsmedlemmerne for deres hjælp. Dette arbejde blev støttet økonomisk af Institut Pasteur.
anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
EDTA | Ion chelator | ||
fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |