Isolamento e caratterizzazione delle cellule immunitarie da plessi coroidi di topo microsezionati
Summary
Questo studio utilizza la citometria a flusso e due diverse strategie di gating su plessi coroidi cerebrali di topi perfusi isolati; questo protocollo identifica i principali sottoinsiemi di cellule immunitarie che popolano questa struttura cerebrale.
Abstract
Il cervello non è più considerato come un organo che funziona in isolamento; l’accumulo di prove suggerisce che i cambiamenti nel sistema immunitario periferico possono indirettamente modellare la funzione cerebrale. All’interfaccia tra il cervello e la circolazione sistemica, i plessi coroidi (CP), che costituiscono la barriera del liquido emato-cerebrospinale, sono stati evidenziati come un sito chiave della comunicazione periferia-cervello. I CP producono il liquido cerebrospinale, i fattori neurotrofici e le molecole di segnalazione che possono modellare l’omeostasi cerebrale. CP sono anche una nicchia immunologica attiva. In contrasto con il parenchima cerebrale, che è popolato principalmente da microglia in condizioni fisiologiche, l’eterogeneità delle cellule immunitarie CP ricapitola la diversità che si trova in altri organi periferici. La diversità e l’attività delle cellule immunitarie CP cambiano con l’invecchiamento, lo stress e la malattia e modulano l’attività dell’epitelio CP, modellando così indirettamente la funzione cerebrale. L’obiettivo di questo protocollo è quello di isolare la CP murina e identificare circa il 90% dei principali sottoinsiemi immunitari che li popolano. Questo metodo è uno strumento per caratterizzare le cellule immunitarie CP e comprendere la loro funzione nell’orchestrare la comunicazione periferia-cervello. Il protocollo proposto può aiutare a decifrare come le cellule immunitarie CP modulano indirettamente la funzione cerebrale in salute e in varie condizioni di malattia.
Introduction
Dalla scoperta della barriera emato-encefalica da parte di Paul Erhlich alla fine del 19 ° secolo, il cervello è stato considerato praticamente separato dagli altri organi e dal flusso sanguigno. Tuttavia, quest’ultimo decennio ha visto l’emergere del concetto che la funzione cerebrale è modellata da vari fattori biologici, come il microbiota intestinale e le cellule immunitarie sistemiche e i segnali1,2,3,4. Parallelamente, altri confini cerebrali come meningi e plessi coroidi (CP) sono stati identificati come interfacce di cross talk immuno-cerebrale attivo piuttosto che tessuti barriera inerti5,6,7,8.
I CP costituiscono la barriera del liquido emato-cerebrospinale, uno dei confini che separano il cervello e la periferia. Si trovano in ciascuno dei quattro ventricoli del cervello, cioè il terzo, il quarto e entrambi i ventricoli laterali, e sono adiacenti alle aree coinvolte nella neurogenesi come la zona subventricolare e la zona subgranulare dell’ippocampo3. Strutturalmente, i CP sono composti da una rete di capillari sanguigni fenestrati racchiusi da un monostrato di cellule epiteliali, che sono interconnesse da giunzioni strette e aderenti9,10. I principali ruoli fisiologici dell’epitelio CP coinvolgono la produzione di liquido cerebrospinale, che lava il cervello dai metaboliti di scarto e dagli aggregati proteici, e la produzione e il passaggio controllato sangue-cervello di varie molecole di segnalazione tra cui ormoni e fattori neurotrofici11,12,13. Le molecole secrete dalla CP modellano l’attività del cervello, cioè modulando la neurogenesi e la funzione microgliale14,15,16,17,18,19, il che rende la CP cruciale per l’omeostasi cerebrale. CP anche impegnarsi in varie attività immunitarie; mentre il principale tipo di cellule immunitarie nel parenchima cerebrale in condizioni non patologiche è la microglia, la diversità delle popolazioni di cellule immunitarie CP è ampia quanto negli organi periferici3,7, suggerendo che vari canali di regolazione immunitaria e segnalazione sono all’opera al CP.
Lo spazio tra le cellule endoteliali ed epiteliali, lo stroma CP, è popolato principalmente da macrofagi associati al bordo (BAM), che esprimono citochine pro-infiammatorie e molecole correlate alla presentazione dell’antigene in risposta ai segnali infiammatori3. Un altro sottotipo di macrofagi, le cellule epiplexus di Kolmer, sono presenti sulla superficie apicale dell’epitelio CP20. CP stroma è anche una nicchia per le cellule dendritiche, cellule B, mastociti, basofili, neutrofili, cellule linfoidi innate e cellule T che sono per lo più cellule T di memoria effettrici in grado di riconoscere gli antigeni del sistema nervoso centrale7,21,22,23,24. Inoltre, la composizione e l’attività delle popolazioni di cellule immunitarie al CP cambiano in caso di perturbazione sistemica o cerebrale, ad esempio durante l’invecchiamento10,14,15,21,25, la perturbazione del microbiota7, lo stress26 e la malattia27,28. In particolare, questi cambiamenti sono stati suggeriti per modellare indirettamente la funzione cerebrale, cioè uno spostamento delle cellule T CP CD4 + verso l’infiammazione Th2 si verifica nell’invecchiamento cerebrale e innesca la segnalazione immunitaria dal CP che può modellare il declino cognitivo associato all’invecchiamento14,15,21,25,29 . Illuminare le proprietà delle cellule immunitarie CP sarebbe quindi cruciale per comprendere meglio la loro funzione regolatrice sulla fisiologia e la secrezione dell’epitelio CP e quindi decifrare il loro impatto indiretto sulla funzione cerebrale in condizioni di salute e malattia.
I CP sono piccole strutture che contengono solo poche cellule immunitarie. Il loro isolamento richiede la microdissezione dopo una fase preliminare di perfusione; le cellule immunitarie nel flusso sanguigno costituirebbero altrimenti i principali contaminanti. Questo protocollo mira a caratterizzare i sottoinsiemi mieloidi e di cellule T del CP utilizzando la citometria a flusso. Questo metodo identifica circa il 90% delle popolazioni di cellule immunitarie che compongono cp di topo in condizioni non infiammatorie, in conformità con lavori pubblicati di recente che utilizzano altri metodi per sezionare l’eterogeneità della CP immunitaria7,10,28. Questo protocollo potrebbe essere applicato per caratterizzare i cambiamenti nel compartimento delle cellule immunitarie CP con malattia e altri paradigmi sperimentali in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli studi volti a comprendere i contributi immunologici all’omeostasi cerebrale e alla malattia si sono concentrati principalmente sulle cellule che risiedono all’interno del parenchima cerebrale, trascurando i confini cerebrali come la CP, che sono tuttavia contributi cruciali alla funzione cerebrale2,3. L’analisi delle popolazioni di cellule immunitarie a CP è difficile a causa delle piccole dimensioni di CP, del basso numero di cellule immunitarie residenti e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo l’Institut Pasteur Animalerie Centrale e i membri della struttura CB-UTechS per il loro aiuto. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dall’Institut Pasteur.
Materials
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
Referências
- Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Deczkowska, A., Schwartz, M. Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities. Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).
- Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection. Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).
- Erny, D., et al. Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS. Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).
- Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
- Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain’s immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
- van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: Biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
- Falcão, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).
- Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
- Mazucanti, C. H., et al. Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling. JCI Insight. 4 (23), (2019).
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Deczkowska, A., et al. Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner. Nature Communications. 8 (1), (2017).
- Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging. Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).
- da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer’s disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Schwarze, E. -. W. The origin of (Kolmer’s) epiplexus cells. Histochemistry. 44 (1), 103-104 (1975).
- Baruch, K., et al. CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).
- Kunis, G., et al. IFN-γ-dependent activation of the brain’s choroid plexus for CNS immune surveillance and repair. Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).
- Goldmann, T., et al. fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces. Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).
- Fung, I. T. H., et al. Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline. Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5, 4111 (2019).
- Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
- Yang, A. C., et al. Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19. Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).
- Baruch, K., et al. PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).
- Baruch, K., et al. Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer’s disease pathology. Nature Communications. 6, 7967 (2015).
- Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells. Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).
- Schafflick, D., et al. Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges. Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).
- Quintana, E., et al. DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain. GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).
- Kabashima, K., et al. Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation. Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
