微小解剖マウス脈絡叢からの免疫細胞の単離と特性評価
Summary
この研究は、単離された灌流マウスの脳脈絡叢に対するフローサイトメトリーおよび2つの異なるゲーティング戦略を使用する。このプロトコルは、この脳構造に移入する主要な免疫細胞サブセットを識別します。
Abstract
脳はもはや孤立して機能する器官とは見なされていません。蓄積された証拠は、末梢免疫系の変化が間接的に脳機能を形作ることができることを示唆している。脳と全身循環の界面では、血液-脳脊髄液関門を構成する脈絡叢(CP)が末梢間通信の重要な部位として強調されている。CPは、脳脊髄液、神経栄養因子、および脳恒常性を形成することができるシグナル伝達分子を産生する。CPはまた、活性免疫学的ニッチである。生理学的条件下で主にミクログリアによって移入される脳実質とは対照的に、CP免疫細胞の不均一性は、他の末梢器官に見られる多様性を反復する。CP免疫細胞の多様性および活性は、加齢、ストレス、および疾患に伴って変化し、CP上皮の活性を調節し、それによって脳機能を間接的に形成する。このプロトコルの目標は、マウスCPを単離し、それらに生息する主要な免疫サブセットの約90%を同定することである。この方法は、CP免疫細胞を特徴付け、末梢と脳のコミュニケーションを調整する際のそれらの機能を理解するためのツールです。提案されたプロトコルは、CP免疫細胞が健康および様々な疾患状態にわたって脳機能を間接的にどのように調節するかを解読するのに役立つかもしれない。
Introduction
19世紀後半にPaul Erhlichによって血液脳関門が発見されて以来、脳は他の臓器や血流から事実上分離されていると考えられてきました。しかし、この過去10年間に、脳機能は腸内微生物叢や全身性免疫細胞、シグナルなどのさまざまな生物学的要因によって形成されるという概念が出現しました1,2,3,4。並行して、髄膜や脈絡叢(CP)などの他の脳境界は、不活性バリア組織ではなく、能動的免疫と脳のクロストークのインターフェースとして同定されている5,6,7,8。
CPは血液脳脊髄液関門を構成し、脳と末梢を隔てる境界の1つである。それらは、脳の4つの心室のそれぞれ、すなわち、第3、第4、および両方の側脳室に位置し、海馬の脳室下帯および顆粒下帯などの神経新生に関与する領域に隣接している3。構造的には、CPは、上皮細胞の単層によって囲まれた有糞性毛細血管のネットワークで構成され、それらは緊密に連結され、接合部を接着する9,10。CP上皮の主な生理学的役割には、老廃代謝産物およびタンパク質凝集体から脳を洗い流す脳脊髄液の産生、ならびにホルモンおよび神経栄養因子を含む様々なシグナル伝達分子の産生および制御された血液から脳への通過が含まれる11,12,13。CPから分泌された分子は、神経新生およびミクログリア機能を調節することによって、脳の活動を形作り14、15、16、17、18、19、CPを脳の恒常性維持に決定的にする。CPはまた、様々な免疫活動に従事する;非病理学的条件下での脳実質における主な免疫細胞型はミクログリアであるのに対し、CP免疫細胞集団の多様性は末梢器官と同様に広範であり3,7、CPでは免疫調節およびシグナル伝達の様々なチャネルが働いていることが示唆される。
内皮細胞と上皮細胞の間の空間であるCP間質は、主に境界関連マクロファージ(BAM)によって移入され、炎症シグナルに応答して抗原提示に関連する前炎症性サイトカインおよび分子を発現する3。マクロファージの別のサブタイプであるコルマーエピプレクサス細胞は、CP上皮20の頂端表面に存在する。CP間質はまた、樹状細胞、B細胞、肥満細胞、好塩基球、好中球、先天性リンパ球細胞、および主にエフェクターメモリーT細胞であるT細胞のためのニッチであり、中枢神経系抗原を認識することができる7、21、22、23、24。さらに、CPにおける免疫細胞集団の組成および活性は、全身または脳の摂動、例えば加齢時10、14、15、21、25、微生物叢摂動7、ストレス26、および疾患27、28の間に変化する。特に、これらの変化は間接的に脳機能を形作ることが示唆された、すなわち、CP CD4+ T細胞のTh2炎症へのシフトが脳の老化で起こり、加齢に伴う認知機能低下を形作る可能性のあるCPからの免疫シグナル伝達を誘発する14,15,21,25,29.したがって、CP免疫細胞の特性を明らかにすることは、CP上皮の生理学および分泌に対するそれらの調節機能をよりよく理解し、それによって健康および疾患条件下での脳機能に対するそれらの間接的な影響を解読するために極めて重要である。
CPは、少数の免疫細胞のみを含む小さな構造である。それらの単離は、灌流の予備段階の後に微小解剖を必要とする。血流中の免疫細胞は、さもなければ主要な汚染物質を構成するであろう。このプロトコルは、フローサイトメトリーを用いてCPの骨髄系およびT細胞サブセットを特徴付けることを目的としている。この方法は、免疫CPの不均一性を解剖するために他の方法を用いて最近発表された研究に従って、非炎症条件下でマウスCPを構成する免疫細胞集団の約90%を同定する7、10、28。このプロトコルは、インビボでの疾患および他の実験パラダイムを伴うCP免疫細胞区画の変化を特徴付けるために適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
脳の恒常性と疾患に対する免疫学的寄与を理解することを目的とした研究は、主に脳実質内に存在する細胞に焦点を当てており、脳機能に重要な寄与者であるCPなどの脳の境界を無視しています2,3。CPにおける免疫細胞集団の分析は、CPのサイズが小さく、常在免疫細胞の数が少なく、この組織への複雑なアクセスのために困難である。全脳免疫細?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
パスツール・アニマルリー・セントラル研究所とCB-UTechS施設のメンバーの皆様のご協力に感謝いたします。この作業はパスツール研究所によって財政的に支援されました。
Materials
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
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