미세 해부된 마우스 맥락막 신경총으로부터 면역 세포의 분리 및 특성화
Summary
이 연구는 분리 된 관류 된 마우스 뇌 맥락막 신경총에 대한 유세포 측정과 두 가지 게이팅 전략을 사용합니다. 이 프로토콜은이 뇌 구조를 채우는 주요 면역 세포 하위 집합을 식별합니다.
Abstract
뇌는 더 이상 고립되어 기능하는 기관으로 간주되지 않습니다. 축적 된 증거는 말초 면역 체계의 변화가 간접적으로 뇌 기능을 형성 할 수 있음을 시사합니다. 뇌와 전신 순환 사이의 계면에서, 혈액 뇌척수액 장벽을 구성하는 맥락막 신경총(CP)은 주변부와 뇌 간 통신의 핵심 부위로 강조되고 있다. CP는 뇌척수액, 신경 영양 인자 및 뇌 항상성을 형성 할 수있는 신호 전달 분자를 생산합니다. CP는 또한 활성 면역 학적 틈새 시장입니다. 생리적 조건 하에서 주로 미세아교세포에 의해 채워지는 뇌 실질과는 달리, CP 면역 세포의 이질성은 다른 말초 기관에서 발견되는 다양성을 되풀이한다. CP 면역 세포 다양성 및 활성은 노화, 스트레스 및 질병에 따라 변화하고 CP 상피의 활성을 조절하여 간접적으로 뇌 기능을 형성합니다. 이 프로토콜의 목표는 뮤린 CP를 분리하고 그들을 채우는 주요 면역 서브 세트의 약 90 %를 확인하는 것입니다. 이 방법은 CP 면역 세포를 특성화하고 주변부와 뇌 간 의사 소통을 조율하는 기능을 이해하는 도구입니다. 제안 된 프로토콜은 CP 면역 세포가 건강 및 다양한 질병 조건에서 간접적으로 뇌 기능을 조절하는 방법을 해독하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
19 세기 후반 Paul Erhlich가 혈액 – 뇌 장벽을 발견 한 이래로 뇌는 다른 장기 및 혈류와 사실상 분리 된 것으로 간주되어 왔습니다. 그러나 지난 10 년 동안 뇌 기능은 장내 미생물 및 전신 면역 세포 및 신호와 같은 다양한 생물학적 요인에 의해 형성된다는 개념의 출현을 보았습니다1,2,3,4. 동시에, 수막과 맥락막 신경총(CP)과 같은 다른 뇌 경계는 불활성 장벽 조직보다는 활성 면역-뇌 교차 대화의 계면으로 확인되었다5,6,7,8.
CP는 뇌와 주변을 분리하는 경계 중 하나 인 혈액 뇌척수액 장벽을 구성합니다. 그들은 뇌의 네 개의 심실, 즉 세 번째, 네 번째 및 양쪽 측심실 각각에 위치하고 있으며 해마의 심실 하부 영역 및 세분화 된 영역과 같은 신경 발생과 관련된 영역에 인접 해 있습니다3. 구조적으로, CP는 상피 세포의 단층으로 둘러싸인 연합 된 혈액 모세 혈관의 네트워크로 구성되며, 이들은 단단하고 부착 된 접합부에 의해 상호 연결되어 있습니다9,10. CP 상피의 주요 생리적 역할은 폐대사산물 및 단백질 응집체로부터 뇌를 세척하는 뇌척수액의 생산과 호르몬 및 신경영양 인자를 포함한 다양한 신호전달 분자의 생산 및 제어된 혈액-뇌 통과를 포함한다11,12,13. CP로부터 분비된 분자는 뇌의 활동, 즉 신경발생과 미세아교세포기능14,15,16,17,18,19을 조절함으로써 뇌의 활동을 형성하며, 이는 CP를 뇌 항상성에 결정적으로 만든다. CP는 또한 다양한 면역 활동에 관여합니다. 비병리학적 조건 하에서 뇌 실질의 주요 면역 세포 유형은 미세아교세포인 반면, CP 면역 세포 집단의 다양성은 말초 기관3,7에서와 같이 광범위하며, 이는 다양한 면역 조절 및 신호전달 채널이 CP에서 작용하고 있음을 시사한다.
내피 세포와 상피 세포 사이의 공간인 CP 스트로마는 주로 염증 신호에 반응하여 전염증성 사이토카인 및 항원 제시와 관련된 분자를 발현하는 경계-관련 대식세포(BAM)에 의해 채워진다3. 대식세포의 또 다른 아형인 콜머의 상복부 세포는 CP 상피20의 정점 표면에 존재한다. CP stroma는 또한 수지상 세포, B 세포, 비만 세포, 호염기구, 호중구, 선천성 림프계 세포 및 중추 신경계 항원을 인식 할 수있는 대부분 이펙터 기억 T 세포 인 T 세포의 틈새 시장입니다7,21,22,23,24. 또한, CP에서의 면역 세포 집단의 조성물 및 활성은 전신 또는 뇌 교란시, 예를 들어, 노화 동안10,14,15,21,25, 미생물 교란7, 스트레스26, 및 질병27,28 동안 변화한다. 주목할 만하게, 이러한 변화는 간접적으로 뇌 기능, 즉 뇌 노화에서 발생하는 Th2 염증으로의 CP CD4+ T 세포의 이동이 제안되었고, 노화와 관련된 인지 저하를 형성할 수 있는 CP로부터의 면역 신호전달을 촉발시킨다14,15,21,25,29 . 따라서 CP 면역 세포의 특성을 조명하는 것은 CP 상피 생리학 및 분비에 대한 조절 기능을 더 잘 이해하고 건강 및 질병 조건에서 뇌 기능에 대한 간접적 인 영향을 해독하는 데 중요합니다.
CP는 단지 몇 개의 면역 세포만을 포함하는 작은 구조이다. 그들의 분리는 관류의 예비 단계 후에 미세 해부를 필요로한다; 혈류의 면역 세포는 그렇지 않으면 주요 오염 물질을 구성 할 것입니다. 이 프로토콜은 유세포 분석기를 사용하여 CP의 골수성 및 T 세포 서브세트를 특성화하는 것을 목표로 한다. 이 방법은 비염증성 조건 하에서 마우스 CP를 구성하는 면역 세포 집단의 약 90%를 확인하는데, 이는 면역 CP 이질성을 해부하기 위한 다른 방법을 사용하는 최근 발표된 연구에 따른다7,10,28. 이 프로토콜은 생체내에서 질병 및 다른 실험적 패러다임과 함께 CP 면역 세포 구획의 변화를 특성화하는데 적용될 수 있었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
뇌 항상성 및 질병에 대한 면역학적 기여를 이해하려는 연구는 주로 뇌 실질 내에 존재하는 세포에 초점을 맞추었고, 그럼에도 불구하고 뇌 기능에 중요한 기여자인 CP와 같은 뇌 경계를 무시했다2,3. CP에서 면역 세포 집단의 분석은 CP의 크기가 작고, 상주 면역 세포의 수가 적으며,이 조직에 대한 복잡한 접근으로 인해 어렵습니다. 총 뇌 면역 세포 (CD45<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Institut Pasteur Animalerie Centrale과 CB-UTechS 시설 회원들에게 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 작업은 파스퇴르 연구소에 의해 재정적으로 지원되었습니다.
Materials
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
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