Isolasjon og karakterisering av immuncellene fra mikro-dissekerte mus Choroid Plexuses
Summary
Denne studien bruker flowcytometri og to forskjellige gating strategier på isolerte perfused mus hjerne choroid plexuses; Denne protokollen identifiserer de viktigste immuncelledelsettene som fyller denne hjernestrukturen.
Abstract
Hjernen anses ikke lenger som et organ som fungerer isolert; akkumulerende bevis tyder på at endringer i det perifere immunsystemet indirekte kan forme hjernefunksjonen. Ved grensesnittet mellom hjernen og den systemiske sirkulasjonen har choroid-plexusene (CP), som utgjør blod-cerebrospinalvæskebarrieren, blitt fremhevet som et viktig sted for periferi-til-hjerne-kommunikasjon. CP produserer cerebrospinalvæsken, nevrotrofiske faktorer og signalmolekyler som kan forme hjernens homeostase. CP er også en aktiv immunologisk nisje. I motsetning til hjernen parenchyma, som er befolket hovedsakelig av mikroglia under fysiologiske forhold, recapitulates heterogeniteten til CP immunceller mangfoldet som finnes i andre perifere organer. CP-immuncellemangfoldet og aktivitetsendringen med aldring, stress og sykdom og modulerer aktiviteten til CP-epitelet, og former dermed indirekte hjernefunksjonen. Målet med denne protokollen er å isolere murine CP og identifisere ca 90% av de viktigste immunundergruppene som fyller dem. Denne metoden er et verktøy for å karakterisere CP immunceller og forstå deres funksjon i orkestrering av periferi-til-hjerne-kommunikasjon. Den foreslåtte protokollen kan bidra til å dechiffrere hvordan CP-immunceller indirekte modulerer hjernefunksjon i helse og på tvers av ulike sykdomstilstander.
Introduction
Siden oppdagelsen av blod-hjernebarrieren av Paul Erhlich på slutten av 1800-tallet, har hjernen blitt ansett som nesten skilt fra de andre organene og blodet. Likevel har dette siste tiåret sett fremveksten av konseptet om at hjernefunksjonen er formet av ulike biologiske faktorer, som tarmmikrobiota og systemiske immunceller og signaler1,2,3,4. Parallelt har andre hjernegrenser som meninger og choroidplexuses (CP) blitt identifisert som grensesnitt for aktiv immun-hjerne kryssprat i stedet for inert barriere vev5,6,7,8.
CP utgjør den blod-cerebrospinale væskebarrieren, en av grensene som skiller hjernen og periferien. De ligger i hver av de fire ventriklene i hjernen, det vil si den tredje, den fjerde og begge laterale ventriklene, og ligger ved siden av områder som er involvert i nevrogenese som subventrikulær sone og subgranulær sone av hippocampus3. Strukturelt består CP av et nettverk av fenesterte blodkapillærer vedlagt av en monolayer av epitelceller, som er sammenkoblet med tette og festekryss9,10. Store fysiologiske roller i CP-epitelet involverer produksjon av cerebrospinalvæske, som spyler hjernen fra avfallsmetabolitter og proteinaggregater, og produksjon og kontrollert blod-til-hjerne-passasje av ulike signalmolekyler, inkludert hormoner og nevrotrofiske faktorer11,12,13. Utskilte molekyler fra CP-formhjernens aktivitet, det vil si ved å modulere nevrogenese og mikroglial funksjon14,15,16,17,18,19, noe som gjør CP avgjørende for hjernens homeostase. CP deltar også i ulike immunaktiviteter; mens den viktigste immuncelletypen i hjernen parenchyma under ikke-patologiske forhold er mikroglia, er mangfoldet av CP immuncellepopulasjoner like bredt som i perifere organer3,7, noe som tyder på at ulike kanaler for immunregulering og signalering er i arbeid ved CP.
Mellomrommet mellom endotel- og epitelceller, CP-stromaen, er hovedsakelig befolket av grenserelaterte makrofager (BAM), som uttrykker proinflammatoriske cytokiner og molekyler relatert til antigenpresentasjon som svar på inflammatoriske signaler3. En annen undertype av makrofager, Kolmers epiplexusceller, er tilstede på den apikale overflaten av CP-epitelet20. CP stroma er også en nisje for dendrittiske celler, B-celler, mastceller, basofiler, nøytrofiler, medfødte lymfoidceller og T-celler som for det meste er effektorminne T-celler som er i stand til å gjenkjenne sentralnervesystemet antigener7,21,22,23,24. I tillegg endres sammensetningen og aktiviteten til immuncellepopulasjoner ved CP på systemisk eller hjerneperturbasjon, for eksempel under aldring av 10,14,15,21,25, mikrobiota perturbasjon7, stress26 og sykdom27,28. Spesielt ble disse endringene foreslått å indirekte forme hjernefunksjonen, det vil si et skifte av CP CD4 + T-celler mot Th2-betennelse oppstår i hjerne aldring og utløser immunsignalering fra CP som kan forme aldringsrelatert kognitiv nedgang14,15,21,25,29 . Å belyse egenskapene til CP-immuncellene vil dermed være avgjørende for å bedre forstå deres regulatoriske funksjon på CP-epitelfysiologi og sekresjon og dermed dechiffrere deres indirekte innvirkning på hjernefunksjonen under sunne og sykdomstilstander.
CP er små strukturer som bare inneholder noen få immunceller. Deres isolasjon krever mikrodisseksjon etter et foreløpig trinn i perfusjon; immunceller i blodet ellers ville utgjøre store forurensninger. Denne protokollen tar sikte på å karakterisere myeloid- og T-celledelsettene til CP ved hjelp av strømningscytometri. Denne metoden identifiserer omtrent 90% av immuncellepopulasjonene som komponerer mus CP under ikke-inflammatoriske forhold, i samsvar med nylig publiserte arbeider ved hjelp av andre metoder for å dissekere immun-CP-heterogenitet7,10,28. Denne protokollen kan brukes til å karakterisere endringer i CP immuncellerommet med sykdom og andre eksperimentelle paradigmer in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studier som tar sikte på å forstå de immunologiske bidragene til hjernens homeostase og sykdom har hovedsakelig fokusert på celler som ligger i hjerneparenchyma, og forsømmer hjernegrenser som CP, som likevel er avgjørende bidragsytere til hjernefunksjon2,3. Analysen av immuncellepopulasjoner ved CP er utfordrende på grunn av den lille størrelsen på CP, lavt antall bosatte immunceller og komplisert tilgang til dette vevet. Flowcytometri utført på total…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Institut Pasteur Animalerie Centrale og cb-UTechS-anleggsmedlemmene for deres hjelp. Dette arbeidet ble støttet økonomisk av Institut Pasteur.
Materials
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
Referências
- Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Deczkowska, A., Schwartz, M. Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities. Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).
- Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection. Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).
- Erny, D., et al. Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS. Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).
- Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
- Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain’s immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
- van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: Biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
- Falcão, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).
- Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
- Mazucanti, C. H., et al. Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling. JCI Insight. 4 (23), (2019).
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Deczkowska, A., et al. Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner. Nature Communications. 8 (1), (2017).
- Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging. Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).
- da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer’s disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Schwarze, E. -. W. The origin of (Kolmer’s) epiplexus cells. Histochemistry. 44 (1), 103-104 (1975).
- Baruch, K., et al. CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).
- Kunis, G., et al. IFN-γ-dependent activation of the brain’s choroid plexus for CNS immune surveillance and repair. Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).
- Goldmann, T., et al. fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces. Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).
- Fung, I. T. H., et al. Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline. Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5, 4111 (2019).
- Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
- Yang, A. C., et al. Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19. Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).
- Baruch, K., et al. PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).
- Baruch, K., et al. Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer’s disease pathology. Nature Communications. 6, 7967 (2015).
- Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells. Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).
- Schafflick, D., et al. Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges. Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).
- Quintana, E., et al. DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain. GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).
- Kabashima, K., et al. Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation. Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
