Isolamento e Caracterização das Células Imunes de Plexos Choroides de Camundongos Micro-dissecados
Summary
Este estudo utiliza citometria de fluxo e duas estratégias diferentes de gating em camundongos isolados com plexos cerebrais coroides; este protocolo identifica os principais subconjuntos de células imunes que povoam essa estrutura cerebral.
Abstract
O cérebro não é mais considerado como um órgão funcionando isoladamente; acumular evidências sugere que mudanças no sistema imunológico periférico podem moldar indiretamente a função cerebral. Na interface entre o cérebro e a circulação sistêmica, os plexos coroides (CP), que constituem a barreira do fluido sangue-cefalorraquidiano, têm sido destacados como um local-chave da comunicação periferia-cérebro. Cp produz o fluido cefalorraquidiano, fatores neurotróficos e moléculas de sinalização que podem moldar a homeostase cerebral. Cp também são um nicho imunológico ativo. Em contraste com o parênquimo cerebral, que é povoado principalmente por microglia em condições fisiológicas, a heterogeneidade das células imunes CP recapitula a diversidade encontrada em outros órgãos periféricos. A diversidade e a atividade das células imunes CP mudam com o envelhecimento, o estresse e a doença e modulam a atividade do epitélio CP, moldando indiretamente a função cerebral. O objetivo deste protocolo é isolar o CP murine e identificar cerca de 90% dos principais subconjuntos imunológicos que os povoam. Este método é uma ferramenta para caracterizar células imunes CP e entender sua função na orquestração da comunicação periférica-cérebro. O protocolo proposto pode ajudar a decifrar como as células imunes cp modulam indiretamente a função cerebral na saúde e em várias condições da doença.
Introduction
Desde a descoberta da barreira hematoencefálica por Paul Erhlich no final do século XIX, o cérebro tem sido considerado virtualmente separado dos outros órgãos e da corrente sanguínea. No entanto, nesta última década, viu o surgimento do conceito de que a função cerebral é moldada por vários fatores biológicos, como microbiota intestinal e células imunes sistêmicas e sinais1,2,3,4. Paralelamente, outras fronteiras cerebrais, como meninges e plexos coroides (CP) foram identificadas como interfaces de conversa transversal-imuno-cérebro ativa em vez de tecidos de barreira inerte5,6,7,8.
O PC constitui a barreira do fluido sangue-cefalorraquidiano, uma das fronteiras que separam o cérebro e a periferia. Eles estão localizados em cada um dos quatro ventrículos do cérebro, ou seja, o terceiro, o quarto, e ambos os ventrículos laterais, e são adjacentes a áreas envolvidas na neurogênese, como a zona subventricular e a zona subgranular do hipocampo3. Estruturalmente, o PC é composto por uma rede de capilares de sangue fenestrados fechados por uma monocamada de células epiteliais, que são interligadas por junções apertadas e aderentes9,10. Os principais papéis fisiológicos do epitélio CP envolvem a produção de fluido cefalorraquidiano, que libera o cérebro de metabólitos de resíduos e agregados proteicos, e a produção e passagem controlada sangue-cérebro de várias moléculas de sinalização, incluindo hormônios e fatores neurotróficos11,12,13. Moléculas secretadas da CP moldam a atividade do cérebro, ou seja, modulando a neurogênese e a função microglial14,15,16,17,18,19, o que torna o CP crucial para a homeostase cerebral. CP também se engaja em várias atividades imunológicas; enquanto o principal tipo de célula imune no parenchyma cerebral em condições não patológicas é a microglia, a diversidade de populações de células imunes CP é tão ampla quanto em órgãos periféricos3,7, sugerindo que vários canais de regulação e sinalização imunológica estão em ação no CP.
O espaço entre as células endotelial e epitelial, o estroma CP, é povoado principalmente por macrófagos associados à borda (BAM), que expressam citocinas pró-inflamatórias e moléculas relacionadas à apresentação de antígenos em resposta a sinais inflamatórios3. Outro subtipo de macrófagos, as células epiplexas de Kolmer, estão presentes na superfície apical do epitélio CP20. O estroma CP também é um nicho para células dendríticas, células B, células de mastro, basófilos, neutrófilos, células linfoides inatas e células T que são principalmente células T efeito ou memória capazes de reconhecer antígenos do sistema nervoso central7,21,22,23,24. Além disso, a composição e a atividade das populações de células imunes no PC alteram a perturbação sistêmica ou cerebral, por exemplo, durante o envelhecimento10,14,15,21,25, microbiota perturbação7, stress26 e doença27,28. Notavelmente, essas alterações foram sugeridas para moldar indiretamente a função cerebral, ou seja, uma mudança das células T CP CD4+ para a inflamação Th2 ocorre no envelhecimento cerebral e desencadeia sinalização imune do PC que pode moldar o declínio cognitivo associado ao envelhecimento14,15,21,25,29 . Iluminar as propriedades das células imunes cp seria, portanto, crucial para entender melhor sua função regulatória na fisiologia e secreção do epitélio CP e, assim, decifrar seu impacto indireto na função cerebral em condições saudáveis e de doenças.
CP são pequenas estruturas que contêm apenas algumas células imunes. Seu isolamento requer microdisseção após uma etapa preliminar de perfusão; células imunes na corrente sanguínea constituiriam contaminantes graves. Este protocolo visa caracterizar os subconjuntos de células mielóide e T do CP usando citometria de fluxo. Este método identifica cerca de 90% das populações de células imunes que compõem o PC do camundongo sob condições não inflamatórias, de acordo com trabalhos recentemente publicados usando outros métodos para dissecar a heterogeneidade cp imune7,10,28. Este protocolo poderia ser aplicado para caracterizar alterações no compartimento de células imunes cp com doenças e outros paradigmas experimentais in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estudos com o objetivo de entender as contribuições imunológicas para a homeostase cerebral e doença têm focado principalmente em células residentes dentro do parenchyma cerebral, negligenciando fronteiras cerebrais como o PC, que são, no entanto, contribuintes cruciais para a função cerebral2,3. A análise das populações de células imunes no PC é desafiadora devido ao pequeno tamanho de CP, baixo número de células imunes residentes e acesso compli…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a ajuda do Institut Pasteur Animalerie Centrale e dos membros das instalações da CB-UTechS. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Institut Pasteur.
Materials
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
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