Aislamiento y caracterización de las células inmunes de plexos coroideos de ratón microdisecados
Summary
Este estudio utiliza citometría de flujo y dos estrategias diferentes de gating en ratones perfundidos aislados plexos coroideos cerebrales; este protocolo identifica los principales subconjuntos de células inmunes que pueblan esta estructura cerebral.
Abstract
El cerebro ya no se considera como un órgano que funciona de forma aislada; La evidencia acumulada sugiere que los cambios en el sistema inmune periférico pueden moldear indirectamente la función cerebral. En la interfaz entre el cerebro y la circulación sistémica, los plexos coroideos (PC), que constituyen la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo, se han destacado como un sitio clave de comunicación de la periferia al cerebro. La PC produce el líquido cefalorraquídeo, los factores neurotróficos y las moléculas de señalización que pueden dar forma a la homeostasis cerebral. Los PC también son un nicho inmunológico activo. En contraste con el parénquima cerebral, que está poblado principalmente por microglia en condiciones fisiológicas, la heterogeneidad de las células inmunes CP recapitula la diversidad que se encuentra en otros órganos periféricos. La diversidad y la actividad de las células inmunes CP cambian con el envejecimiento, el estrés y la enfermedad y modulan la actividad del epitelio CP, dando forma indirectamente a la función cerebral. El objetivo de este protocolo es aislar la PC murina e identificar alrededor del 90% de los principales subconjuntos inmunes que los pueblan. Este método es una herramienta para caracterizar las células inmunes CP y comprender su función en la orquestación de la comunicación de la periferia al cerebro. El protocolo propuesto puede ayudar a descifrar cómo las células inmunes CP modulan indirectamente la función cerebral en la salud y en diversas afecciones de la enfermedad.
Introduction
Desde el descubrimiento de la barrera hematoencefálica por Paul Erhlich a finales del siglo 19, el cerebro se ha considerado virtualmente separado de los otros órganos y el torrente sanguíneo. Sin embargo, esta última década ha visto la aparición del concepto de que la función cerebral está formada por varios factores biológicos, como la microbiota intestinal y las células y señales inmunes sistémicas1,2,3,4. Paralelamente, se han identificado otros bordes cerebrales como las meninges y los plexos coroideos (PC) como interfaces de diafonía inmunocerebral activa en lugar de tejidos de barrera inertes5,6,7,8.
La PC constituye la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo, uno de los bordes que separan el cerebro y la periferia. Se localizan en cada uno de los cuatro ventrículos del cerebro, es decir, el tercero, el cuarto y ambos ventrículos laterales, y son adyacentes a áreas implicadas en la neurogénesis como la zona subventricular y la zona subgranular del hipocampo3. Estructuralmente, los CP están compuestos por una red de capilares sanguíneos fenestrados encerrados por una monocapa de células epiteliales, que están interconectadas por uniones estrechas y adheridas9,10. Las principales funciones fisiológicas del epitelio CP implican la producción de líquido cefalorraquídeo, que elimina el cerebro de los metabolitos de desecho y los agregados de proteínas, y la producción y el paso controlado de sangre a cerebro de varias moléculas de señalización, incluidas las hormonas y los factores neurotróficos11,12,13. Las moléculas secretadas de la PC dan forma a la actividad del cerebro, es decir, modulando la neurogénesis y la función microglial14,15,16,17,18,19, lo que hace que la PC sea crucial para la homeostasis cerebral. CP también participa en diversas actividades inmunes; mientras que el principal tipo de célula inmune en el parénquima cerebral en condiciones no patológicas es la microglía, la diversidad de las poblaciones de células inmunes CP es tan amplia como en los órganos periféricos3,7, lo que sugiere que varios canales de regulación inmune y señalización están en funcionamiento en la PC.
El espacio entre las células endoteliales y epiteliales, el estroma CP, está poblado principalmente por macrófagos asociados al borde (BAM), que expresan citoquinas proinflamatorias y moléculas relacionadas con la presentación de antígenos en respuesta a señales inflamatorias3. Otro subtipo de macrófagos, las células del epiplexo de Kolmer, están presentes en la superficie apical del epitelio CP20. El estroma CP también es un nicho para las células dendríticas, células B, mastocitos, basófilos, neutrófilos, células linfoides innatas y células T que son en su mayoría células T de memoria efectoras capaces de reconocer antígenos del sistema nervioso central7,21,22,23,24. Además, la composición y actividad de las poblaciones de células inmunes en la PC cambia con la perturbación sistémica o cerebral, por ejemplo, durante el envejecimiento10,14,15,21,25, la perturbación de la microbiota7, el estrés26 y la enfermedad27,28. En particular, se sugirió que estos cambios moldean indirectamente la función cerebral, es decir, se produce un cambio de las células T CP CD4 + hacia la inflamación Th2 en el envejecimiento cerebral y desencadena la señalización inmune de la PC que puede dar forma al deterioro cognitivo asociado al envejecimiento14,15,21,25,29 . Por lo tanto, iluminar las propiedades de las células inmunes CP sería crucial para comprender mejor su función reguladora en la fisiología y secreción del epitelio CP y, por lo tanto, descifrar su impacto indirecto en la función cerebral en condiciones sanas y de enfermedad.
La PC son pequeñas estructuras que contienen sólo unas pocas células inmunes. Su aislamiento requiere microdisección después de un paso preliminar de perfusión; de lo contrario, las células inmunes en el torrente sanguíneo constituirían contaminantes importantes. Este protocolo tiene como objetivo caracterizar los subconjuntos mieloides y de células T de la PC mediante citometría de flujo. Este método identifica alrededor del 90% de las poblaciones de células inmunes que componen la PC de ratón en condiciones no inflamatorias, de acuerdo con trabajos publicados recientemente que utilizan otros métodos para diseccionar la heterogeneidad de la PC inmune7,10,28. Este protocolo podría aplicarse para caracterizar cambios en el compartimento de células inmunes CP con enfermedad y otros paradigmas experimentales in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los estudios destinados a comprender las contribuciones inmunológicas a la homeostasis y la enfermedad cerebral se han centrado principalmente en las células que residen dentro del parénquima cerebral, descuidando las fronteras cerebrales como la PC, que sin embargo son contribuyentes cruciales a la función cerebral2,3. El análisis de las poblaciones de células inmunes en CP es un desafío debido al pequeño tamaño de CP, el bajo número de células inmune…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Institut Pasteur Animalerie Centrale y a los miembros de las instalaciones de CB-UTechS por su ayuda. Este trabajo fue apoyado financieramente por el Institut Pasteur.
Materials
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
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