Caracterización tridimensional de sitios de contacto interorgánicos en hepatocitos mediante microscopía electrónica de sección serie

Summary

Un protocolo simple y completo para adquirir detalles tridimensionales de los sitios de contacto de membrana entre orgánulos en hepatocitos del hígado o células en otros tejidos.

Abstract

La microscopía electrónica de transmisión se ha considerado durante mucho tiempo como el estándar de oro para la visualización de la ultraestructura celular. Sin embargo, el análisis a menudo se limita a dos dimensiones, lo que dificulta la capacidad de describir completamente la ultraestructura tridimensional (3D) y la relación funcional entre los orgánulos. La microscopía electrónica de volumen (vEM) describe una colección de técnicas que permiten el interrogatorio de la ultraestructura celular en 3D a resoluciones de mesoescala, microescala y nanoescala.

Este protocolo proporciona un método accesible y robusto para adquirir datos vEM utilizando la transmisión de sección serie EM (TEM) y cubre los aspectos técnicos del procesamiento de muestras hasta la reconstrucción digital en 3D en un flujo de trabajo único y sencillo. Para demostrar la utilidad de esta técnica, se presenta la relación ultraestructural 3D entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias y sus sitios de contacto en los hepatocitos hepáticos. Los contactos interorgánicos desempeñan funciones vitales en la transferencia de iones, lípidos, nutrientes y otras moléculas pequeñas entre orgánulos. Sin embargo, a pesar de su descubrimiento inicial en los hepatocitos, todavía hay mucho que aprender sobre sus características físicas, dinámicas y funciones.

Los contactos interorgánicos pueden mostrar una variedad de morfologías, que varían en la proximidad de los dos orgánulos entre sí (típicamente ~ 10-30 nm) y la extensión del sitio de contacto (desde contactos punteados hasta contactos cisternales 3D más grandes). El examen de contactos cercanos requiere imágenes de alta resolución, y la TEM de sección seriada es muy adecuada para visualizar la ultraestructural 3D de los contactos interorgánicos durante la diferenciación de hepatocitos, así como las alteraciones en la arquitectura de los hepatocitos asociadas con enfermedades metabólicas.

Introduction

Desde su invención en la década de 1930, los microscopios electrónicos han permitido a los investigadores visualizar los componentes estructurales de las células y los tejidos ^1,2. La mayoría de las investigaciones han proporcionado información 2D, ya que la construcción de modelos 3D requiere una minuciosa colección de secciones en serie, fotografía manual, procesamiento negativo, rastreo manual y la creación y ensamblaje de modelos 3D a partir de láminas de vidrio, plástico o espuma de^{poliestireno 3,4}. Casi 70 años después, ha habido avances considerables en numerosos aspectos del proceso, desde el rendimiento del microscopio, la recolección de secciones en serie, la imagen digital automatizada, el software y el hardware sofisticados para la reconstrucción, visualización y análisis 3D hasta los enfoques alternativos para lo que ahora se denomina colectivamente EM de volumen (vEM). En general, se considera que estas técnicas de vEM proporcionan información ultraestructural 3D a resoluciones nanométricas a través de escalas de micras y abarcan la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y las nuevas técnicas de microscopía electrónica de barrido (SEM); ver reseñas 5,6,7,8.

Por ejemplo, el haz de iones enfocado SEM (FIB-SEM) utiliza un haz de iones enfocado dentro de un SEM para fresar la superficie del bloque entre escaneos secuenciales de imágenes SEM de la superficie del bloque, lo que permite el fresado / imagen automatizado repetido de una muestra y la construcción de un conjunto de datos 3D para la reconstrucción ^9,10. Por el contrario, el SEM de cara de bloque serie (SBF-SEM) utiliza un ultramicrotomo dentro del SEM para eliminar el material de la cara del bloque antes de obtener imágenes^11,12, mientras que la tomografía de matriz es un proceso no destructivo que requiere la recopilación de secciones en serie, en hojas de cubierta, obleas o cinta, antes de configurar un flujo de trabajo automatizado de imágenes de la región de interés en secciones secuenciales en el SEM para generar el conjunto de datos 3D¹³ . Similar a la tomografía de matriz, la sección seriada TEM (ssTEM) requiere que las secciones físicas se recopilen antes de la toma de imágenes; sin embargo, estas secciones se recogen en cuadrículas TEM y se visualizan en un TEM 14,15,16. ssTEM se puede ampliar realizando tomografía de inclinación 17,18,19. La tomografía de inclinación en serie proporciona la mejor resolución en x, y y z, y aunque se ha utilizado para reconstruir células enteras²⁰, es razonablemente desafiante. Este protocolo se centra en los aspectos prácticos de ssTEM como la técnica de vEM más accesible disponible para muchos laboratorios de EM que actualmente no tienen acceso a seccionamiento especializado o instrumentos de vEM, pero se beneficiarían de la generación de datos de vEM 3D.

La ultramicrotomía en serie para la reconstrucción 3D se ha considerado previamente un desafío. Era difícil cortar cintas rectas de espesor de sección uniforme, poder organizar y recoger cintas del tamaño correcto, en el orden correcto, en rejillas con suficiente soporte, pero sin barras de rejilla que oscurecieran las regiones de interés, y lo más importante, sin perder secciones, ya que una serie incompleta puede evitar la reconstrucción 3D completa²¹. Sin embargo, las mejoras en los ultramicrotomías comerciales, los cuchillos de corte y recorte de diamantes^22,23, las películas de soporte de electrones en rejillas^21,24 y los adhesivos para ayudar a la adhesión de la sección y la preservación de la cinta^13,21 son solo algunos de los avances incrementales a lo largo de los años que han hecho que la técnica sea más rutinaria en muchos laboratorios. Una vez que se han recopilado las secciones en serie, las imágenes en serie en TEM son sencillas y pueden proporcionar imágenes EM con tamaños de px del subnanómetro en x e y, lo que permite el interrogatorio de alta resolución de las estructuras subcelulares, un requisito potencial para muchas preguntas de investigación. El estudio de caso aquí presentado demuestra el uso de ssTEM y reconstrucción 3D en el estudio de los contactos endoplásmicos retículo (RE)-orgánulo en hepatocitos hepáticos, donde se observaron por primera vez contactos ER-orgánulos^25,26.

Si bien es contiguo con la envoltura nuclear, el RE también hace contactos cercanos con muchos otros orgánulos celulares, incluidos los lisosomas, las mitocondrias, las gotas de lípidos y la membrana plasmática²⁷. Los contactos ER-orgánulos se han implicado en el metabolismo lipídico²⁸, la señalización de fosfoinositida y calcio²⁹, la regulación de la autofagia y la respuesta al estrés^30,31. Los contactos ER-orgánulos y otros contactos interorgánicos son estructuras altamente dinámicas que responden a las necesidades metabólicas celulares y las señales extracelulares. Se ha demostrado que varían morfológicamente en su tamaño y forma y las distancias entre las membranas de orgánulos^32,33. Se cree que es probable que estas diferencias ultraestructurales reflejen sus diferentes composiciones de proteínas/lípidos y su función^34,35. Sin embargo, sigue siendo una tarea difícil definir los contactos interorgánicos y analizarlos³⁶. Por lo tanto, se requiere un protocolo confiable pero simple para examinar y caracterizar los contactos interorgánicos para futuras investigaciones.

Como los contactos ER-orgánulo pueden variar de 10 a 30 nm en la separación de membrana a membrana, el estándar de oro para la identificación ha sido históricamente TEM. Tem de sección delgada ha revelado localización específica de subdominios para proteínas ER residentes en distintos contactos de membrana³⁷. Tradicionalmente, esto ha revelado contactos de orgánulos ER con resolución nm, pero a menudo solo presentaba una vista 2D de estas interacciones. Sin embargo, los enfoques vEM revelan la presentación ultraestructural y el contexto de estos sitios de contacto en 3D, lo que permite la reconstrucción completa de los contactos y una clasificación más precisa de los contactos (punto vs. tubular vs. cisternal-tipo) y cuantificación^38,39. Además de ser el primer tipo celular donde se observaron contactos ER-orgánulo^25,26, los hepatocitos tienen un extenso sistema de otros contactos interorgánicos que cumplen funciones vitales en su arquitectura y fisiología^28,40. Sin embargo, todavía falta una caracterización morfológica completa del orgánulo ER y otros contactos interorgánicos en los hepatocitos. En consecuencia, la forma en que los contactos interorgánicos se forman y remodelan durante la regeneración y la reparación es de particular relevancia para la biología de los hepatocitos y la función hepática.

Protocol

Todos los animales fueron alojados de acuerdo con las directrices del Ministerio del Interior del Reino Unido, y la recolección de tejidos se llevó a cabo de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido de 1986. 1. Fijación y preparación de la muestra Diseccionar el tejido hepático en trozos de tamaño apropiado, aproximadamente 8 mm x 8 mm x 3 mm, y colocar las piezas en solución salina tamponada con fosfato tibio (PBS, 37 °C)….

Representative Results

Para esta técnica, las regiones de interés se seleccionan en función del objetivo de la investigación biológica y se identifican antes del recorte y seccionamiento del tejido incrustado. Del mismo modo, el tamaño de la cara del bloque puede ser dictado por la pregunta de investigación; en este caso, la muestra se recortó para dejar una cara de bloque de aproximadamente 0,3 mm x 0,15 mm (Figura 4A). Esto permitió dos rejillas de 9 secciones en serie por rejilla, proporcionando 18 sec…

Discussion

En este protocolo se describe una técnica vEM accesible para visualizar la estructura de orgánulos y las interacciones en 3D. La morfología de los contactos interorgánicos en los hepatocitos se presenta como un estudio de caso aquí. Sin embargo, este enfoque también se ha aplicado para investigar una variedad de otras muestras y áreas de investigación, incluidas las interacciones célula-endotelial de Schwann en nervios periféricos⁴⁵, la biogénesis corporal de Weibel Palade en células e…

Materials

0.22 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
Aluminum trays	Agar Scientific	AGG3912
Amira v6	ThermoFisher		https://www.thermofisher.com
Chloroform	Fisher	C/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride	TAAB	T027	Epon ingredient
Diamond knife	DiaTOME	ultra 45°
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol	TAAB	D032	Epon ingredient
Dumont Tweezers N5	Agar Scientific	AGT5293
Fiji			https://imagej.net/
Fiji TrakEM2 plugin			https://imagej.net/
Formaldehyde 36% solution	TAAB	F003
Formvar coated slot grid	Homemade		Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)
Glass bottle with applicator rod	Medisca	6258
Glass vials	Fisher Scientific	15364769
Gluteraldehyde 25% solution	TAAB	G011
MNA/Methyl Nadic Anhydride	TAAB	M011	Epon ingredient
Osmium Tetroxide 2% solution	TAAB	O005
Potassium Ferricyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene oxide	Fisher Scientific	E/0050/PB08
Reuseable adhesive	Blue Tack
Reynolds Lead Citrate	TAAB	L037	Section stain
Sodium Cacodylate	Sigma-Aldrich	C-0250	to make 0.1 M Caco buffer
Super Glue	RS Components	918-6872	Cyanoacrylate glue, Step 1.3
TAAB 812 Resin	TAAB	T023	Epon ingredient
Tannic acid	TAAB	T046
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Two part Epoxy Resin	RS Components	132-605	Alternative: Step 2.13
Ultramicrotome	Leica	UC7
Vibrating microtome	Leica		100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .
Weldwood Original Contact cement	DAP	107	Contact adhesive: Step 3.1.4