O presente protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo de colite semelhante a Crohn em roedores. A inflamação transmural leva à estenose no local de instilação do TNBS, e o alargamento mecânico é observado no segmento proximal à estenose. Essas mudanças permitem estudar o estresse mecânico na colite.
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Artigo de método
Um modelo de roedor induzido pela TNBS para estudar o papel patogênico do estresse mecânico na doença de Crohn
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Neste artigo
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Resumo
Resumo
Doenças inflamatórias intestinais (DII) como a doença de Crohn (CD) são doenças inflamatórias crônicas do trato gastrointestinal que afetam aproximadamente 20 por 1.00.000 na Europa e nos EUA. O CD é caracterizado por inflamação transmural, fibrose intestinal e estenose luminal. Embora terapias anti-inflamatórias possam ajudar a controlar a inflamação, elas não têm eficácia na fibrose e estenose em CD. A patogênese do CD não é bem compreendida. Os estudos atuais se concentram principalmente na delineação de mecanismos de resposta imune intestinal desregulados. Embora a inflamação transmural associada ao CD, a fibrose intestinal e a estenose luminal representem estresse mecânico na parede intestinal, o papel do estresse mecânico no CD não é bem definido. Para determinar se o estresse mecânico desempenha um papel patogênico independente no CD, um protocolo do modelo de colite induzida por TNBS em roedores foi desenvolvido. Este modelo de inflamação transmural e fibrose induzido pelo TNBS se assemelha a marcas patológicas do CD no cólon. É induzida pela instilação intracolônica de TNBS no cólon distal de ratos adultos Sprague-Dawley. Neste modelo, a inflamação transmural leva à estenose no local de instilação do TNBS (Site I). A distensão mecânica é observada na porção proximal ao local de instilação (Local P), representando estresse mecânico, mas não inflamação visível. A porção córica distal à inflamação (Local D) não apresenta inflamação nem estresse mecânico. Foram observadas alterações distintas da expressão genética, resposta imune, fibrose e crescimento muscular suave em diferentes locais (P, I e D), destacando um profundo impacto do estresse mecânico. Portanto, este modelo de colite semelhante a CD nos ajudará a entender melhor os mecanismos patogênicos do CD, particularmente o papel do estresse mecânico e da expressão genética induzida pelo estresse mecânico na desregulação imunológica, fibrose intestinal e remodelação tecidual em CD.
Introdução
A doença inflamatória intestinal (DII), incluindo colite ulcerativa (UC) e doença de Crohn (CD), é caracterizada por inflamação crônica no trato gastrointestinal (GI). Afeta ~1-2 milhões de americanos1. Os custos anuais estimados para os cuidados com o IBD nos EUA são de US$ 11,8 bilhões. Ao contrário da UC, o CD é caracterizado pela inflamação transmural e formação de rigidridade 2,3. A formação rigorosa (estenose) ocorre em até 70% dos pacientes com CD3 e pode ser causada por inflamação transmural (estenose inflamatória) ou fibrose intestinal (estenose fibrosa)....
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Protocolo
Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com o comitê institucional de cuidados e uso de animais da University of Texas Medical Branch (#0907051C). Ratos de Sprague-Dawley masculinos ou femininos, com ~8-9 semanas de idade, foram usados para o estudo.
1. Preparação animal
- Ratos rápidos por 24 horas e tratá-los com laxante (limpador de intestino, ver Tabela de Materiais) durante a noite.
- No dia seguinte, anestesiam ratos usando um sistema de anestesia (ver Tabela de Materiais) expondo-os a 2% de isoflurane, juntamente com 1 L/min de oxigênio durante a a....
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Resultados
Visão macroscópica da colite semelhante a Crohn induzida pela instilação intra-cólon do TNBS
Como mostrado na Figura 1, a instilação intracolônica de TNBS em ratos induziu uma inflamação transmural localizada (~2 cm de comprimento) com parede intestinal espessa e lúmen estreito (estenose) no local da instilação no cólon distal (Figura 1A). O site da instilação TNBS é referido como site I. Como resultado de inflamação transmural e estenose, ta.......
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Discussão
A colite induzida pelo TNBS foi introduzida em 1989 e tem sido usada como modelo experimental da doença de Crohn desde então 19,20,23. Características significativas deste modelo em roedores incluem o desenvolvimento de uma inflamação transmural que se assemelha muito às lesões histopatológicas desenvolvidas na doença humana de Crohn19,20. Estudos anteriores sobre o mode.......
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Divulgações
Os autores não relatam conflito de interesses e não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado em parte por subvenções do NIH (R01 DK124611 para XZS) e do Departamento de Defesa dos EUA (W81XWH-20-1-0681 para XZS). O trabalho de histologia foi feito com a ajuda do Laboratório de Patologia Cirúrgica da UTMB.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Software de controle ACT-1 Ver2.63 | Nikon | DXM1200F | |
| C1000 Touch Thermal Cycler com módulo de reação rápida de 96 poços | BIO-RAD | 1851196 | |
| Módulo de reação óptica CFX96 para sistemas de PCR em tempo real | BIO-RAD | 1845097 | |
| Dako Agilent Artisan Link Pro Coloração especial | Dako | AR310 | |
| Dako-Agilent Masson's Kit Tricrômico ref# AR173 | Dako | AR173 | |
| DXM1200 Câmera Digital Color HR | Nikon | DXM1200 | |
| Eucariótico 18S rRNA Controle Endógeno | ThermoFisher Scientific | 4352930E | |
| E-Z Anesthesia | E-Z Systems Inc. | EZ-155 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad | 9.0.2 (161) | |
| Placas PCR de 96 poços de casca dura, perfil baixo, parede fina, saia, branco/transparente | BIO-RAD | HSP9601 | |
| HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x sem cálcio e magnésio) | CORNING | 21-021-CV | |
| HM 325 Microtome | Thermo Scientific | 23-900-667 | |
| Isoflurano | Piramal | NDC 66794-017-10 | |
| LI-COR Odyssey Digital Imaging System | LI-COR | 9120 | |
| Mastercycler epGradient Termociclador com Painel de Controle 5340 Termociclador | Eppendorf | 5341 | |
| Cateter de poliuretano aberto de grau médico | |||
| NanoDrop 2000 / 2000c | Microscópio Vertical Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Nikon Eclipse E800 | E800 | ||
| Pkg de 50, 0.45 μ m, 7 x 8,5 cm | BIO-RAD | 1620215 | |
| Polietilenoglicol 3350, Laxante Osmótico | Miralax | C8175 | Dose: 17g em 226 mL de água |
| RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Colunas de Centrifugação, Tubos de Coleta (1,5 mL e 2 mL), Reagentes e Tampões Livres de RNase | QIAGEN | 74106 | |
| Sistema de Síntese de Fita Inicial SuperScript III | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| Ensaios de expressão gênica TaqMan Rn00573960_g1 sonda CTGF | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Ensaios de expressão gênica TaqMan Rn99999011_m1 sonda IL6 | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4444557 | |
| Tissue-Tek Prisma H & Kit de coloração E # 1 | Sakura | 6190 | |
| Tissue-Tek Prisma Plus < / em> Automated Slide Stainer | Sakura | 6171 | |
| TNBS (solução de ácido picrilsulfônico) | SIGMA-ALDRICH | 92822 |
Referências
- Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
- Hwang, J. M., Varma, M. G.
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 5/20/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.
The first sentence of the Introduction was updated from:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
to:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
Step 1.3 in the Protocol was updated from:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.
to:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.
