Análisis de proteinuria, infiltración renal de leucocitos y depósito renal de proteínas en ratones LMR/LPR propensos al lupus
Summary
El presente protocolo describe un método para rastrear la progresión del lupus en ratones. Se presentan dos procedimientos adicionales para caracterizar la nefritis lúpica basada en la infiltración celular y la deposición de proteínas en los riñones.
Abstract
El lupus eritematoso sistémico (LES) es un trastorno autoinmune sin cura conocida y se caracteriza por una inflamación persistente en muchos órganos, incluidos los riñones. En tales circunstancias, el riñón pierde su capacidad de limpiar los desechos de la sangre y regular las concentraciones de sal y líquidos, lo que eventualmente conduce a insuficiencia renal. Las mujeres, particularmente las en edad fértil, son diagnosticadas nueve veces más a menudo que los hombres. La enfermedad renal es la principal causa de mortalidad en pacientes con LES. El presente protocolo describe un método rápido y simple para medir los niveles de proteína excretada en la orina recolectada, rastreando la progresión del lupus a lo largo del tiempo. Además, se proporciona un enfoque para aislar células mononucleares renales basado en la selección de tamaño y densidad para investigar la infiltración renal de leucocitos. Además, se ha desarrollado un método inmunohistoquímico para caracterizar la deposición de proteínas en los glomérulos y la infiltración leucocitaria en el espacio tubulointersticial. Juntos, estos métodos pueden ayudar a investigar la progresión de la inflamación crónica asociada con los riñones de ratones MRL / lpr propensos al lupus.
Introduction
La función principal del riñón es la eliminación de sustancias tóxicas a través de la orina, manteniendo la homeostasis del agua y las sales1. Esta función está amenazada en pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES), lo que lleva a la llamada nefritis lúpica (LN). LN es una consecuencia de que el sistema inmune ataca el riñón, lo que lleva a una inflamación renal persistente, por lo tanto, pierde su capacidad para limpiar los desechos de la sangre y regular las concentraciones de sal y líquidos. Esto eventualmente conducirá a insuficiencia renal, que puede ser fatal. Durante el proceso nefrítico, las células B circulantes, las células T y los monocitos se reclutan en el riñón, secretando quimiocinas, citoquinas y autoanticuerpos formadores de complejos inmunes. En última instancia, esto resulta en daño de las células endoteliales, lesiones membranosas, atrofia tubular renal y fibrosis2.
Los ratones propensos al lupus MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) son un modelo clásico de ratón que exhibe signos clínicos similares al lupus que se asemejan al LES humano3. Este modelo ha sido fundamental para comprender una de las principales causas de mortalidad en pacientes con LES, la nefritis lúpica (LN)4. Tanto en el LES humano como en el ratón, la LN se caracteriza por una inflamación gradual desencadenada por la deposición renal de complejos inmunes, seguida de la activación del complemento, el reclutamiento de células inflamatorias y la pérdida de la función renal5. El depósito del complejo inmune es el primer paso para inducir la producción de quimiocinas y citoquinas por las células renales intrínsecas, lo que expande la respuesta inflamatoria al reclutar células inmunes6. El protocolo actual presenta varias técnicas para seguir la progresión de la enfermedad renal que analizan la infiltración celular y la deposición de complejos inmunes.
La orina recolectada cada semana permite la detección y visualización del curso temporal de la proteinuria antes, durante y después del inicio del lupus. La proteinuria como biomarcador puede determinar la progresión biológica de la LN. Otras ventajas de esta técnica son que no es invasiva, rentable y fácil de implementar7. Cuando el riñón está funcionando perfectamente, el nivel de proteinuria es consistentemente bajo; sin embargo, en ratones LMR/LPR, después de las 8-9 semanas de edad, se observa un aumento gradual del nivel de proteinuria, que finalmente es lo suficientemente alto como para causar insuficiencia renal8. Múltiples tiras de reactivos y reactivos colorimétricos están disponibles comercialmente para monitorear el problema. Sin embargo, el ensayo de Bradford es barato y muy preciso para determinar la aparición de proteinuria y el curso de la nefritis lúpica. Este ensayo es rápido y el reactivo no se ve afectado por la presencia de disolventes, tampones, agentes reductores y agentes quelantes de metales que pueden estar en su muestra 9,10,11.
Un aspecto importante a considerar es la infiltración celular en el riñón. Estos infiltrados promueven la patogénesis al desencadenar la secreción de factores solubles como las citoquinas para empeorar la inflamación12. Para comprender mejor qué poblaciones celulares están presentes en los infiltrados, un método útil es aislar leucocitos13. Aquí, la detección de la infiltración renal de las células B se utiliza como ejemplo. El procedimiento comienza con un proceso de digestión con desoxirribonucleasa (DNasa) y colagenasa, seguido de una separación de gradiente de densidad que elimina desechos, glóbulos rojos y granulocitos densos. La razón para aislar las células B (CD19+) y las células plasmáticas (CD138+) es que los riñones lúpicos pueden concentrar estas células14. Se sugiere que la presencia de células B en pequeños agregados en el riñón puede indicar expansión clonal y, en consecuencia, producción de inmunoglobulina (Ig). Se sabe que las células plasmáticas también están presentes en estos agregados15. Una vez que se han aislado los leucocitos, se puede utilizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para analizar las células de interés al teñir con diferentes anticuerpos conjugados con fluorescencia.
La inmunofluorescencia es uno de los métodos de detección de inmunohistoquímica (IHC) que permite la visualización fluorescente de proteínas en muestras de tejido renal de 4 μm de espesor. Otros métodos de detección de IHQ dependen de la naturaleza de los analitos, la química de unión y otros factores16. La inmunofluorescencia es un método de identificación rápida que expone el antígeno a su anticuerpo homólogo marcado con un fluorocromo específico (o un colorante fluorescente). Cuando se excita, produce luz que un microscopio de fluorescencia puede detectar. Esta técnica puede ser utilizada para observar la deposición del complemento C3 e IgG2a17. La activación excesiva de la cascada del complemento podría estar asociada con una respuesta inmune incontrolada y pérdida de función18. La deposición inmune de autoanticuerpos anti-ADN bicatenario (anti-dsDNA) en el riñón es una preocupación importante19, donde aquellos con isotipo IgG2a se han asociado con LN20. Específicamente, los anticuerpos anti-dsDNA exhiben más patogenicidad y afinidad con los materiales nucleares, formando complejos inmunes21. Cuando la IgG2a está presente, la cascada del complemento, incluyendo C3, se activa para eliminar los complejos inmunes22. Los marcadores C3 e IgG2a se pueden cuantificar individualmente o superpuestos para establecer su correlación.
En particular, la medición de la creatinina sérica es otra técnica confiable que se puede usar junto con hematuria microscópica y biopsias renales para diagnosticar LN23. Sin embargo, la presencia de proteinuria es un fuerte indicador de daño glomerular. En ese sentido, el monitoreo del nivel de proteinuria durante el lupus puede detectar la aparición de la enfermedad y complementar otros métodos para diagnosticar el lupus. Además, los complejos inmunes depositados en los glomérulos pueden inducir una respuesta inflamatoria, activar el sistema del complemento y reclutar más células inflamatorias. Otro punto destacable de este protocolo es la infiltración de células B en el riñón. Esto, junto con las células T infiltradas, amplifica las respuestas inmunes locales que desencadenan el daño orgánico. Es importante destacar que la clasificación de LN no solo se basa en los cambios morfológicos glomerulares observados en microscopía, sino también en los depósitos inmunes observados con inmunofluorescencia. Por lo tanto, en este protocolo, se ofrecen métodos precisos y rentables para el análisis de la función renal en entornos de laboratorio.
Protocol
Representative Results
Discussion
La LN es una de las principales causas de mortalidad en pacientes con LES, y los factores que agravan la enfermedad siguen sin estar claros. La aplicación de este protocolo consiste en caracterizar la función renal utilizando múltiples métodos, incluida la medición de proteinuria, el análisis FACS de leucocitos renales aislados y la tinción por inmunofluorescencia de secciones renales congeladas.
Un punto importante a considerar al recolectar orina es que uno tiene que ser consistente c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Flow Cytometry Core Facility, al Laboratorio de Histopatología, al Centro de Imágenes Fralin del Instituto Politécnico de Virginia y a la Universidad Estatal por su apoyo técnico. Este trabajo es apoyado por varios NIH y subvenciones internas.
Materials
| 10x Tris-Buffered Saline (TBS) | Thermo Fisher Scientific | J60764.K2 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Anti-Human/Mouse C3 | Cedarlane | CL7632F | |
| Anti-Mouse CD138 BV711 | Biolegend | 142519 | |
| Anti-Mouse CD45 AF700 | Biolegend | 103127 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich | 11088882001 | |
| Confocal Microscope LSM 880 | Zeiss | LSM 880 | |
| Coplin jar | Fisher Scientific | 50-212-281 | |
| Cryomold | Fisher Scientific | NC9511236 | |
| Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Percoll |
| DEPC-Treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9906 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| dsDNA-EC | InvivoGen | tlrl-ecdna | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid | Fisher Scientific | S311-500 | EDTA |
| EVOS M5000 Microscope imaging system | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | |
| FACS Fusion Cell sorter | BD Biosciences | FACS Fusion | |
| Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated | R&D systems | S11150H | |
| Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Graphpad prism | GraphPad | N/A | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | N/A | |
| Lactobacillus reuteri Kandler et al. | ATCC | 23272 | |
| MEM non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr) | Jackson Lab | 485 | |
| Nail enamel | N/A | N/A | Any conventional store |
| O.C.T compound | Tisse-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Polysciences | R-30 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 70011069 | |
| Pierce 20x TBS Buffer | Thermo Fisher Scientific | 28358 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23236 | Albumin standard included |
| ProLon Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553141 | FcR block |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.1 software |
| Sterile cell Strainers 100 µM | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Vancomycin Hydrochloride | Goldbio | V-200-1 | |
| Zombie Aqua | Biolegend | 423102 | fluorescent dye for flow cytometry analysis |
Referências
- Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
- Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
- Maldonado, M. A., et al. The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice. Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).
- Lech, M., Anders, H. J. The pathogenesis of lupus nephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).
- Bagavant, H., Fu, S. M. Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus. Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).
- Li, Q. Z., et al. Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).
- Aragón, C. C., et al. Urinary biomarkers in lupus nephritis. Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042 (2020).
- Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
- Lu, T. -. S., Yiao, S. -. Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -. L. Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification. North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).
- Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. How should proteinuria be detected and measured. Annals of Clinical Biochemistry. 46, 205-217 (2009).
- Viswanathan, G., Upadhyay, A. Assessment of proteinuria. Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).
- Hsieh, C., et al. Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring. Arthritis Care & Research. 63 (6), 865-874 (2011).
- Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bariéty, J. Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis. Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).
- Chang, A., et al. In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis. Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).
- Schrezenmeier, E., Jayne, D., Dörner, T. Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives. Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).
- Fitzgibbons, P. L., et al. Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).
- Lewis, M. J., Botto, M. Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity. Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).
- Watanabe, H., et al. Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B. Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).
- Yin, Z., et al. IL-10 regulates murine lupus. Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).
- Singh, R. R., et al. Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis. Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).
- van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).
- Zuniga, R., et al. Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles. Arthritis & Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).
- Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
- Cabana-Puig, X., et al. Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota. Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).
- Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
- Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes. Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).
- Park, J. G. -., et al. Immune cell composition in normal human kidneys. Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
- Okutucu, B., Dınçer, A., Habib, &. #. 2. 1. 4. ;., Zıhnıoglu, F. Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).
