Análises de Proteinúria, Infiltração Renal de Leucócitos e Deposição Renal de Proteínas em Camundongos MRL/lpr propensos a Lúpus

Summary

O presente protocolo descreve um método para rastrear a progressão do lúpus em camundongos. Dois procedimentos adicionais são apresentados para caracterizar a nefrite lúpus com base na infiltração celular e na deposição de proteínas nos rins.

Abstract

O lúpus eritematoso sistêmico (SLE) é uma doença autoimune sem cura conhecida e é caracterizada por inflamação persistente em muitos órgãos, incluindo os rins. Sob tais circunstâncias, o rim perde sua capacidade de limpar resíduos do sangue e regular concentrações de sal e fluidos, eventualmente levando à insuficiência renal. As mulheres, particularmente as em idade fértil, são diagnosticadas nove vezes mais frequentemente do que os homens. A doença renal é a principal causa de mortalidade em pacientes com SLE. O presente protocolo descreve um método rápido e simples para medir os níveis de proteína excretada na urina coletada, acompanhando a progressão do lúpus ao longo do tempo. Além disso, uma abordagem para isolar as células mononucleares renais é fornecida com base na seleção de tamanho e densidade para investigar a infiltração renal de leucócitos. Além disso, um método imunohistoquímico foi desenvolvido para caracterizar a deposição proteica na infiltração glomeruli e leucócito no espaço tubulointersticial. Juntos, esses métodos podem ajudar a investigar a progressão da inflamação crônica associada aos rins de camundongos mrl/lpr propensos ao lúpus.

Introduction

A função primária do rim é a eliminação de substâncias tóxicas através da urina, mantendo a homeostase da água e sais¹. Esta função está ameaçada em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (SLE), levando à chamada nefrite lúpus (LN). A LN é uma consequência do sistema imunológico atacar o rim, levando a inflamações renais persistentes, perdendo assim sua capacidade de limpar resíduos do sangue e regular concentrações de sal e fluidos. Isso eventualmente levará à insuficiência renal, que pode ser fatal. Durante o processo nefrástico, células B circulantes, células T e monócitos são recrutados para o rim, secretando quimiocinas, citocinas e autoanticorpos de formação de complexos imunológicos. Isso resulta em danos nas células endoteliais, lesões membranous, atrofia tubular renal e fibrose².

MRL/Mp-Fas^lpr (MRL/lpr) é um modelo clássico de rato que exibe sinais clínicos semelhantes ao lúpus que se assemelham ao SLE³ humano. Este modelo tem sido fundamental na compreensão de uma das principais causas de mortalidade em pacientes com SLE, a nefrite lúpus (LN)⁴. Tanto no SLE humano quanto no camundongo, a LN é caracterizada por inflamação gradual desencadeada pela deposição renal de complexos imunológicos, seguida de ativação complementar, recrutamento de células inflamatórias e perda da função renal⁵. A deposição do complexo imunológico é o primeiro passo para induzir a produção de quimiocina e citocinas por células renais intrínsecas, o que expande a resposta inflamatória recrutando células imunes⁶. O protocolo atual apresenta várias técnicas para acompanhar a progressão da doença renal que analisam a infiltração celular e a deposição do complexo imunológico.

A urina coletada toda semana permite a detecção e visualização do curso de tempo de proteinúria antes, durante e depois do início do lúpus. Proteinúria como biomarcador pode determinar a progressão biológica da LN. Outras vantagens dessa técnica são que ela é não invasiva, econômica e fácil de implementar⁷. Quando o rim está funcionando perfeitamente, o nível de proteinúria é consistentemente baixo; no entanto, em camundongos MRL/lpr, após 8-9 semanas de idade, observa-se um aumento gradual do nível de proteinúria, que eventualmente é alto o suficiente para causar insuficiência renal⁸. Várias tiras de reagente e reagentes colorimétricos estão disponíveis comercialmente para monitorar o problema. No entanto, o ensaio de Bradford é barato e muito preciso na determinação do aparecimento de proteinúria e o curso de nefrite lúpus. Este ensaio é rápido, e o reagente não é afetado pela presença de solventes, buffers, agentes de redução e agentes de corte de metal que podem estar em sua amostra ^9,10,11.

Um aspecto importante a considerar é a infiltração celular no rim. Esses infiltrados promovem a patogênese desencadeando a secreção de fatores solúveis, como citocinas, para piorar a inflamação¹². Para entender melhor quais populações celulares estão presentes nos infiltrados, um método útil é isolar os leucócitos¹³. Aqui, a detecção de infiltração renal de células B é usada como exemplo. O procedimento começa com um processo de digestão com desoxyribonuclease (DNase) e colagenase, seguido pela separação gradiente de densidade que remove detritos, glóbulos vermelhos e granulócitos densos. A razão para isolar células B (CD19⁺) e células plasmáticas (CD138⁺) é que os rins de lúpus podem concentrar essas células¹⁴. Sugere-se que a presença de células B em pequenos agregados no rim pode indicar expansão clonal e, consequentemente, produção de imunoglobulina (Ig). As células plasmáticas são bem conhecidas por estarem presentes nestes agregados, bem como¹⁵. Uma vez que os leucócitos tenham sido isolados, a triagem celular ativada pela fluorescência (FACS) pode ser usada para analisar as células de interesse ao coloração com diferentes anticorpos conjugados pela fluorescência.

A imunofluorescência é um dos métodos de detecção de imunohistoquímica (IHC) que permite a visualização fluorescente de proteínas em amostras de tecido renal de 4 μm de espessura. Outros métodos de detecção de IHC dependem da natureza dos analitos, química de vinculação e outros fatores¹⁶. A imunofluorescência é um método de identificação rápida que expõe o antígeno ao seu anticorpo de contrapartida rotulado com um fluorocromo específico (ou um corante fluorescente). Quando excitado, produz luz que um microscópio de fluorescência pode detectar. Esta técnica pode ser usada para observar a deposição do complemento C3 e IgG2a¹⁷. A ativação excessiva da cascata de complementos pode estar associada a uma resposta imune descontrolada e perda de função¹⁸. A deposição imune de autoanticorpos de DNA anti-dsDNA (anti-dsDNA) no rim é uma grande preocupação¹⁹, onde aqueles com isótipo IgG2a foram associados com LN²⁰. Especificamente, anticorpos anti-dsDNA apresentam mais patogenicidade e afinidade com materiais nucleares, formando complexos imunológicos²¹. Quando o IgG2a está presente, a cascata complementar, incluindo c3, é ativada para limpar os complexos imunológicos²². Os marcadores C3 e IgG2a podem ser quantificados individualmente ou sobrepostos para estabelecer sua correlação.

Notavelmente, a medição da creatinina sé serum é outra técnica confiável que pode ser usada em conjunto com hematuria microscópica e biópsias renais para diagnosticar LN²³. No entanto, a presença de proteinúria é um forte indicador de danos glomerulares. Nesse sentido, o monitoramento do nível de proteinúria durante o lúpus pode detectar o aparecimento da doença e complementar outros métodos para o diagnóstico de lúpus. Além disso, os complexos imunológicos depositados em glomeruli podem induzir uma resposta inflamatória, ativar o sistema complementar e recrutar mais células inflamatórias. Outro ponto importante deste protocolo é a infiltração de células B no rim. Isso, juntamente com as células T infiltradas, amplifica as respostas imunes locais que desencadeiam danos nos órgãos. É importante ressaltar que a classificação da LN não se baseia apenas em alterações morfológicas glomerulares vistas na microscopia, mas também depósitos imunológicos observados com imunofluorescência. Portanto, neste protocolo, métodos precisos e econômicos para a análise da função renal são oferecidos em ambientes laboratoriais.

Protocol

O presente protocolo é aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Virginia Tech. Como a doença de lúpus tem maior incidência em fêmeas, apenas os camundongos femininos mrl/lpr foram utilizados. A coleta de amostras foi iniciada com 4 semanas de idade e terminada com 15 semanas. Os camundongos foram obtidos a partir de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais) e foram criados e mantidos em um ambiente específico livre de patógenos seguindo as diretrizes institucio…

Representative Results

O protocolo utiliza vários métodos para avaliar camundongos MRL/lpr para nefrite lúpus. Primeiro, um procedimento é descrito para estudar o aumento dos níveis de proteinúria devido à disfunção renal ao longo do tempo. Como mostrado na Figura 1, os camundongos fêmeas foram tratados com gavage oral de 200 μL de soro fisco tamponado (1x PBS) como o grupo controle e o probiótico Lactobacillus reuteri como o grupo de tratamento, numa concentração de 109 cfu/mL, d…

Discussion

A LN é uma das principais causas de mortalidade em pacientes com SLE, e os fatores que agravam a doença permanecem incertos. A aplicação deste protocolo é caracterizar a função renal utilizando múltiplos métodos, incluindo medição de proteinúria, análise FACS de leucócitos renais isolados e coloração de imunofluorescência de seções renais congeladas.

Um ponto importante a considerar durante a coleta de urina é que é preciso ser consistente com a hora do dia e a localizaç?…

Materials

10x Tris-Buffered Saline (TBS)	Thermo Fisher Scientific	J60764.K2
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985-023
Anti-Human/Mouse C3	Cedarlane	CL7632F
Anti-Mouse CD138 BV711	Biolegend	142519
Anti-Mouse CD45 AF700	Biolegend	103127
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418-100G
Collagenase D	Sigma-Aldrich	11088882001
Confocal Microscope LSM 880	Zeiss	LSM 880
Coplin jar	Fisher Scientific	50-212-281
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236
Density gradient medium	GE Healthcare	17-1440-02	Percoll
DEPC-Treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9906
DNase I	Sigma-Aldrich	D4527
dsDNA-EC	InvivoGen	tlrl-ecdna
Ethylenediaminetetraacetic Acid	Fisher Scientific	S311-500	EDTA
EVOS M5000 Microscope imaging system	Thermo Fisher Scientific	AMF5000
FACS Fusion Cell sorter	BD Biosciences	FACS Fusion
Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated	R&D systems	S11150H
Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates	Fisher Scientific	12-565-501
Graphpad prism	GraphPad	N/A
Hank’s Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14175-079
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
ImageJ software	National Institutes of Health	N/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al.	ATCC	23272
MEM non-essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)	Jackson Lab	485
Nail enamel	N/A	N/A	Any conventional store
O.C.T compound	Tisse-Tek	4583
PAP pen	Sigma-Aldrich	Z377821
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Polysciences	R-30
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	70011069
Pierce 20x TBS Buffer	Thermo Fisher Scientific	28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit	Thermo Fisher Scientific	23236	Albumin standard included
ProLon Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553141	FcR block
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
Sodium pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-070
SpectraMax M5	Molecular Devices	N/A	SoftMax Pro 6.1 software
Sterile cell Strainers 100 µM	Fisher Scientific	22363549
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Vancomycin Hydrochloride	Goldbio	V-200-1
Zombie Aqua	Biolegend	423102	fluorescent dye for flow cytometry analysis