Lupus Eğilimli MRL/lpr Farelerde Proteinüri, Lökositlerin Renal İnfiltrasyonu ve Proteinlerin Renal Birikimi Analizleri
Summary
Mevcut protokol, farelerde lupus ilerlemesini izlemek için bir yöntem açıklamaktadır. Böbreklerde hücre infiltrasyonu ve protein birikimine bağlı lupus nefritini karakterize etmek için iki ek prosedür sunulmuştur.
Abstract
Sistemik lupus eritematozus (SLE), tedavisi bilinmeyen otoimmün bir hastalıktır ve böbrekler de dahil olmak üzere birçok organda kalıcı inflamasyon ile karakterizedir. Bu koşullar altında, böbrek atıkları kandan temizleme ve tuz ve sıvı konsantrasyonlarını düzenleme yeteneğini kaybeder ve sonunda böbrek yetmezliğine yol açar. Kadınlar, özellikle doğurganlık çağındakiler, erkeklerden dokuz kat daha sık teşhis edilir. SLE hastalarında böbrek hastalığı önde gelen mortalite nedenidir. Mevcut protokol, toplanan idrarda atılan protein seviyelerini ölçmek ve zaman içinde lupus ilerlemesini izlemek için hızlı ve basit bir yöntem tanımlamaktadır. Ek olarak, lökositlerin renal infiltrasyonunu araştırmak için boyut ve yoğunluk seçimine dayalı olarak böbrek mononükleer hücrelerini izole etmek için bir yaklaşım sağlanmıştır. Ayrıca, glomerüllerde protein birikimini ve tübülointerstisyel boşlukta lökosit infiltrasyonunu karakterize etmek için immünohistokimyasal bir yöntem geliştirilmiştir. Birlikte, bu yöntemler lupus eğilimli MRL / lpr farelerinin böbrekleri ile ilişkili kronik inflamasyonun ilerlemesini araştırmaya yardımcı olabilir.
Introduction
Böbreğin birincil işlevi, su ve tuzların homeostazını korurken idrar yoluyla toksik maddelerin elimine edilmesidir1. Bu fonksiyon, sistemik lupus eritematozuslu (SLE) hastalarda tehdit altındadır ve lupus nefritine (LN) yol açar. LN, bağışıklık sisteminin böbreğe saldırmasının bir sonucudur, bu da kalıcı böbrek iltihabına yol açar, bu nedenle atıkları kandan temizleme ve tuz ve sıvı konsantrasyonlarını düzenleme yeteneğini kaybeder. Bu sonunda ölümcül olabilen böbrek yetmezliğine yol açacaktır. Nefritik süreç sırasında, dolaşımdaki B hücreleri, T hücreleri ve monositler böbreğe alınır, kemokinler, sitokinler ve immün kompleks oluşturan otoantikorlar salgılanır. Bu sonuçta endotel hücre hasarı, membranöz yaralanmalar, renal tübüler atrofi ve fibroz2 ile sonuçlanır.
MRL / Mp-Fas lpr (MRL / lpr) lupus eğilimli fareler, insan SLE3’e benzeyen lupus benzeri klinik bulgular sergileyen klasik bir fare modelidir. Bu model, SLE hastalarında mortalitenin önde gelen nedenlerinden biri olan lupus nefritinin (LN)4 anlaşılmasında etkili olmuştur. Hem insan hem de fare SLE’sinde LN, immün komplekslerin renal birikimi ile tetiklenen kademeli inflamasyon, ardından kompleman aktivasyonu, enflamatuar hücrelerin işe alınması ve böbrek fonksiyon kaybı ile karakterizedir5. İmmün kompleks birikimi, intrinsik böbrek hücreleri tarafından kemokin ve sitokin üretimini indüklemek için ilk adımdır ve bu da immün hücreleri işe alarak enflamatuar yanıtı genişletir6. Mevcut protokol, böbrek hastalığı progresyonunu takip etmek için hücre infiltrasyonunu ve immün kompleks birikimini analiz eden çeşitli teknikler sunmaktadır.
Her hafta toplanan idrar, lupus başlangıcından önce, sırasında ve sonrasında proteinürinin zaman seyrinin tespit edilmesini ve görselleştirilmesini sağlar. Bir biyobelirteç olarak proteinüri, LN’nin biyolojik ilerlemesini belirleyebilir. Bu tekniğin diğer avantajları, invaziv olmayan, uygun maliyetli ve uygulanması kolayolmasıdır 7. Böbrek mükemmel çalıştığında, proteinüri seviyesi sürekli olarak düşüktür; Bununla birlikte, MRL / lpr farelerinde, 8-9 haftalıktan sonra, proteinüri seviyesinde, sonunda böbrek yetmezliğine neden olacak kadar yüksek olan kademeli bir artış gözlenir8. Sorunu izlemek için çok sayıda reaktif şeridi ve kolorimetrik reaktifler ticari olarak temin edilebilir. Bununla birlikte, Bradford testi, proteinürinin başlangıcını ve lupus nefritinin seyrini belirlemede ucuz ve çok doğrudur. Bu tahlil hızlıdır ve reaktif, numunenizde bulunabilecek çözücülerin, tamponların, indirgeyici ajanların ve metal şelatlama ajanlarının varlığından etkilenmez 9,10,11.
Dikkate alınması gereken önemli bir husus, böbrekte hücre infiltrasyonudur. Bu infiltrasyonlar, inflamasyonu kötüleştirmek için sitokinler gibi çözünür faktörlerin salgılanmasını tetikleyerek patogenezi teşvik eder12. Sızıntılarda hangi hücre popülasyonlarının bulunduğunu daha iyi anlamak için, yararlı bir yöntem lökositleri izole etmektir13. Burada, B hücrelerinin renal infiltrasyonunun tespiti örnek olarak kullanılmıştır. Prosedür, deoksiribonükleaz (DNaz) ve kollajenaz içeren bir sindirim işlemi ile başlar, ardından döküntüleri, kırmızı kan hücrelerini ve yoğun granülositleri gideren yoğunluk gradyanı ayrımı ile devam eder. B hücrelerini (CD19+) ve plazma hücrelerini (CD138+) izole etmenin nedeni, lupus böbreklerinin bu hücreleri konsantre edebilmesidir14. Böbrekteki küçük agregalarda B hücrelerinin varlığının klonal genişlemeyi ve dolayısıyla immünoglobulin (Ig) üretimini gösterebileceği öne sürülmektedir. Plazma hücrelerinin bu agregalarda da mevcut olduğu iyi bilinmektedir15. Lökositler izole edildikten sonra, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), farklı floresan konjuge antikorlarla boyandıktan sonra ilgili hücreleri analiz etmek için kullanılabilir.
İmmünofloresan, 4 μm kalınlığındaki böbrek dokusu örneklerinde proteinlerin floresan olarak görüntülenmesini sağlayan immünohistokimya (IHC) tespit yöntemlerinden biridir. Diğer IHC tespit yöntemleri, analitlerin doğasına, bağlayıcı kimyaya ve diğer faktörlere bağlıdır16. İmmünofloresan, antijeni spesifik bir florokrom (veya floresan boya) ile etiketlenmiş muadili antikora maruz bırakan hızlı bir tanımlama yöntemidir. Heyecanlandığında, floresan mikroskobun tespit edebileceği ışık üretir. Bu teknik, kompleman C3 ve IgG2a17’nin birikimini gözlemlemek için kullanılabilir. Aşırı kompleman kaskad aktivasyonu, kontrolsüz bir immün yanıt ve fonksiyon kaybı ile ilişkili olabilir18. Böbrekte anti-çift sarmallı DNA (anti-dsDNA) otoantikorlarının immün birikimi, IgG2a izotipine sahip olanların LN20 ile ilişkili olduğu büyük bir endişe kaynağıdır19. Spesifik olarak, anti-dsDNA antikorları, nükleer materyallere daha fazla patojenite ve afinite göstererek bağışıklık kompleksleri oluşturur21. IgG2a mevcut olduğunda, bağışıklık komplekslerini temizlemek için C3 dahil olmak üzere kompleman kaskadı aktive edilir22. C3 ve IgG2a belirteçleri ayrı ayrı ölçülebilir veya korelasyonlarını oluşturmak için üst üste bindirilebilir.
Özellikle, serum kreatinin ölçümü, LN23’ü teşhis etmek için mikroskobik hematüri ve böbrek biyopsileri ile birlikte kullanılabilecek başka bir güvenilir tekniktir. Bununla birlikte, proteinüri varlığı glomerüler hasarın güçlü bir göstergesidir. Bu anlamda, lupus sırasında proteinüri seviyesinin izlenmesi, hastalığın başlangıcını tespit edebilir ve lupus tanısı için diğer yöntemleri tamamlayabilir. Ek olarak, glomerüllerde biriken bağışıklık kompleksleri enflamatuar bir yanıtı indükleyebilir, kompleman sistemini aktive edebilir ve daha fazla enflamatuar hücre alabilir. Bu protokolün dikkat çeken bir diğer noktası da böbrekte B hücresi infiltrasyonudur. Bu, infiltre edilmiş T hücreleri ile birlikte, organ hasarını tetikleyen lokal bağışıklık tepkilerini arttırır. Daha da önemlisi, LN’nin sınıflandırılması sadece mikroskopide görülen glomerüler morfolojik değişikliklere değil, aynı zamanda immünofloresan ile gözlenen immün birikintilere de dayanmaktadır. Bu nedenle, bu protokolde, laboratuvar ortamlarında böbrek fonksiyonlarının analizi için doğru ve uygun maliyetli yöntemler sunulmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
LN, SLE hastalarında mortalitenin önde gelen nedenlerinden biridir ve hastalığı şiddetlendiren faktörler belirsizliğini korumaktadır. Bu protokolün uygulanması, proteinüri ölçümü, izole böbrek lökositlerinin FACS analizi ve donmuş böbrek bölümlerinin immünofloresan boyanması dahil olmak üzere çoklu yöntemler kullanarak böbrek fonksiyonunu karakterize etmektir.
İdrar toplarken göz önünde bulundurulması gereken önemli bir nokta, günün saati ve idrar toplama ye…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Teknik destek için Flow Cytometry Core Facility, Histopathology Laboratory, Fralin Imaging Center at Virginia Polytechnic Institute ve State University’ye teşekkür ederiz. Bu çalışma çeşitli NIH ve dahili hibelerle desteklenmektedir.
Materials
| 10x Tris-Buffered Saline (TBS) | Thermo Fisher Scientific | J60764.K2 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Anti-Human/Mouse C3 | Cedarlane | CL7632F | |
| Anti-Mouse CD138 BV711 | Biolegend | 142519 | |
| Anti-Mouse CD45 AF700 | Biolegend | 103127 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich | 11088882001 | |
| Confocal Microscope LSM 880 | Zeiss | LSM 880 | |
| Coplin jar | Fisher Scientific | 50-212-281 | |
| Cryomold | Fisher Scientific | NC9511236 | |
| Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Percoll |
| DEPC-Treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9906 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| dsDNA-EC | InvivoGen | tlrl-ecdna | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid | Fisher Scientific | S311-500 | EDTA |
| EVOS M5000 Microscope imaging system | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | |
| FACS Fusion Cell sorter | BD Biosciences | FACS Fusion | |
| Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated | R&D systems | S11150H | |
| Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Graphpad prism | GraphPad | N/A | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | N/A | |
| Lactobacillus reuteri Kandler et al. | ATCC | 23272 | |
| MEM non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr) | Jackson Lab | 485 | |
| Nail enamel | N/A | N/A | Any conventional store |
| O.C.T compound | Tisse-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Polysciences | R-30 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 70011069 | |
| Pierce 20x TBS Buffer | Thermo Fisher Scientific | 28358 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23236 | Albumin standard included |
| ProLon Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553141 | FcR block |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.1 software |
| Sterile cell Strainers 100 µM | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Vancomycin Hydrochloride | Goldbio | V-200-1 | |
| Zombie Aqua | Biolegend | 423102 | fluorescent dye for flow cytometry analysis |
Referências
- Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
- Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
- Maldonado, M. A., et al. The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice. Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).
- Lech, M., Anders, H. J. The pathogenesis of lupus nephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).
- Bagavant, H., Fu, S. M. Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus. Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).
- Li, Q. Z., et al. Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).
- Aragón, C. C., et al. Urinary biomarkers in lupus nephritis. Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042 (2020).
- Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
- Lu, T. -. S., Yiao, S. -. Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -. L. Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification. North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).
- Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. How should proteinuria be detected and measured. Annals of Clinical Biochemistry. 46, 205-217 (2009).
- Viswanathan, G., Upadhyay, A. Assessment of proteinuria. Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).
- Hsieh, C., et al. Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring. Arthritis Care & Research. 63 (6), 865-874 (2011).
- Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bariéty, J. Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis. Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).
- Chang, A., et al. In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis. Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).
- Schrezenmeier, E., Jayne, D., Dörner, T. Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives. Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).
- Fitzgibbons, P. L., et al. Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).
- Lewis, M. J., Botto, M. Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity. Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).
- Watanabe, H., et al. Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B. Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).
- Yin, Z., et al. IL-10 regulates murine lupus. Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).
- Singh, R. R., et al. Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis. Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).
- van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).
- Zuniga, R., et al. Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles. Arthritis & Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).
- Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
- Cabana-Puig, X., et al. Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota. Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).
- Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
- Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes. Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).
- Park, J. G. -., et al. Immune cell composition in normal human kidneys. Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
- Okutucu, B., Dınçer, A., Habib, &. #. 2. 1. 4. ;., Zıhnıoglu, F. Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).
