本方案描述了一种跟踪小鼠狼疮进展的方法。提出了另外两种程序来表征基于细胞浸润和肾脏中蛋白质沉积的狼疮性肾炎。
系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫性疾病,没有已知的治愈方法,其特征是许多器官(包括肾脏)的持续炎症。在这种情况下,肾脏失去了清除血液中的废物并调节盐和液体浓度的能力,最终导致肾功能衰竭。女性,特别是育龄妇女,被诊断出的频率是男性的九倍。肾脏疾病是系统性红斑狼疮患者死亡的主要原因。本方案描述了一种快速简单的方法来测量收集的尿液中排泄的蛋白质水平,跟踪狼疮随时间的进展。此外,根据大小和密度选择,提供了一种分离肾脏单核细胞的方法,以研究白细胞的肾脏浸润。此外,已经开发了一种免疫组织化学方法来表征肾小球中的蛋白质沉积和肾小管间质空间中的白细胞浸润。总之,这些方法可以帮助研究与易患狼疮的MRL / lpr小鼠的肾脏相关的慢性炎症的进展。
肾脏的主要功能是通过尿液消除有毒物质,同时保持水和盐的稳态1。该功能在系统性红斑狼疮(SLE)患者中受到威胁,导致所谓的狼疮性肾炎(LN)。LN是免疫系统攻击肾脏的结果,导致持续的肾脏炎症,因此失去了清除血液中废物和调节盐和液体浓度的能力。这最终将导致肾功能衰竭,这可能是致命的。在肾炎过程中,循环的B细胞,T细胞和单核细胞被招募到肾脏,分泌趋化因子,细胞因子和免疫复合物形成自身抗体。这最终导致内皮细胞损伤,膜损伤,肾小管萎缩和纤维化2。
容易出现狼疮的小鼠是一种经典的小鼠模型,表现出类似于人类SLE3的狼疮样临床体征。该模型有助于了解SLE患者死亡的主要原因之一,狼疮性肾炎(LN)4。在人和小鼠SLE中,LN的特征在于由肾沉积的免疫复合物引发的逐渐炎症,随后是补体激活,炎症细胞募集和肾功能丧失5。免疫复合物沉积是内在肾细胞诱导趋化因子和细胞因子产生的第一步,其通过招募免疫细胞6来扩展炎症反应。目前的方案提出了几种跟踪肾脏疾病进展的技术,分析细胞浸润和免疫复合物沉积。
每周收集的尿液可以检测和可视化狼疮发作之前、期间和之后的蛋白尿病程。蛋白尿作为生物标志物可以决定LN的生物学进展。该技术的其他优点是它是非侵入性的,具有成本效益的,并且易于实施7。当肾脏完美工作时,蛋白尿水平始终很低;然而,在MRL / lpr小鼠中,在8-9周龄后,观察到蛋白尿水平的逐渐增加,最终高到足以引起肾功能衰竭8。市面上有多种试剂条和比色试剂来监测问题。然而,Bradford测定在确定蛋白尿的发作和狼疮性肾炎的病程方面是廉价且非常准确的。该测定速度快,试剂不受样品中可能存在的溶剂、缓冲液、还原剂和金属螯合剂的影响9,10,11。
要考虑的一个重要方面是肾脏中的细胞浸润。这些浸润通过触发可溶性因子(如细胞因子)的分泌来促进发病机制,从而加重炎症12。为了更好地了解浸润中存在哪些细胞群,一种有用的方法是分离白细胞13。这里,以检测B细胞肾浸润为例。该过程从脱氧核糖核酸酶(DNase)和胶原酶的消化过程开始,然后是密度梯度分离,以去除碎片,红细胞和致密的粒细胞。分离B细胞(CD19 +)和浆细胞(CD138 +)的原因是狼疮肾可以浓缩这些细胞14。有人认为,肾脏中小聚集体中存在B细胞可以表明克隆性扩增,从而产生免疫球蛋白(Ig)。众所周知,浆细胞也存在于这些聚集体中15。一旦分离出白细胞,荧光活化细胞分选(FACS)可用于在用不同的荧光偶联抗体染色时分析感兴趣的细胞。
免疫荧光是免疫组化(IHC)检测方法之一,允许在4μm厚的肾脏组织样品中对蛋白质进行荧光可视化。其他IHC检测方法取决于分析物的性质、结合化学和其他因素16。免疫荧光是一种快速鉴定方法,可将抗原暴露于用特定荧光染料(或荧光染料)标记的对应抗体中。当激发时,它产生荧光显微镜可以检测到的光。该技术可用于观察补体C3和IgG2a17的沉积。过量的补体级联激活可能与不受控制的免疫反应和功能丧失有关18.肾脏中抗双链DNA(抗dsDNA)自身抗体的免疫沉积是一个主要问题19,其中具有IgG2a同种型的抗体与LN20相关。具体而言,抗dsDNA抗体对核材料表现出更多的致病性和亲和力,形成免疫复合物21。当存在IgG2a时,包括C3在内的补体级联反应被激活以清除免疫复合物22。C3和IgG2a标记可以单独量化或叠加以建立其相关性。
值得注意的是,血清肌酐测量是另一种可靠的技术,可以与显微镜下血尿和肾活检一起使用来诊断LN23。然而,蛋白尿的存在是肾小球损伤的强烈指标。从这个意义上说,监测狼疮期间的蛋白尿水平可以检测疾病发作并补充其他诊断狼疮的方法。此外,沉积在肾小球中的免疫复合物可以诱导炎症反应,激活补体系统,并招募更多的炎症细胞。该协议的另一个值得注意的点是B细胞浸润在肾脏中。这与浸润的T细胞一起放大了引发器官损伤的局部免疫反应。重要的是,LN的分类不仅基于显微镜下可见的肾小球形态变化,还基于免疫荧光观察到的免疫沉积物。因此,在该协议中,在实验室环境中提供了用于分析肾功能的准确性和成本效益的方法。
LN是SLE患者死亡的主要原因,加重该病的因素尚不清楚。该方案的应用是使用多种方法表征肾功能,包括蛋白尿的测量,分离的肾白细胞的FACS分析以及冷冻肾切片的免疫荧光染色。
收集尿液时要考虑的一个要点是,必须与一天中的时间和尿液收集的位置一致。小鼠是夜间活动的动物,因此在小鼠开始活跃之前的下午晚些时候收集最准确的样本。选择这个时间的另一个原因是MR…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢流式细胞术核心设施、组织病理学实验室、弗吉尼亚理工学院 Fralin 成像中心和州立大学的技术支持。这项工作得到了各种NIH和内部赠款的支持。
10x Tris-Buffered Saline (TBS) | Thermo Fisher Scientific | J60764.K2 | |
2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
Anti-Human/Mouse C3 | Cedarlane | CL7632F | |
Anti-Mouse CD138 BV711 | Biolegend | 142519 | |
Anti-Mouse CD45 AF700 | Biolegend | 103127 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
Collagenase D | Sigma-Aldrich | 11088882001 | |
Confocal Microscope LSM 880 | Zeiss | LSM 880 | |
Coplin jar | Fisher Scientific | 50-212-281 | |
Cryomold | Fisher Scientific | NC9511236 | |
Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Percoll |
DEPC-Treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9906 | |
DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
dsDNA-EC | InvivoGen | tlrl-ecdna | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid | Fisher Scientific | S311-500 | EDTA |
EVOS M5000 Microscope imaging system | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | |
FACS Fusion Cell sorter | BD Biosciences | FACS Fusion | |
Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated | R&D systems | S11150H | |
Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
Graphpad prism | GraphPad | N/A | |
Hank’s Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-079 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
ImageJ software | National Institutes of Health | N/A | |
Lactobacillus reuteri Kandler et al. | ATCC | 23272 | |
MEM non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr) | Jackson Lab | 485 | |
Nail enamel | N/A | N/A | Any conventional store |
O.C.T compound | Tisse-Tek | 4583 | |
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Polysciences | R-30 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 70011069 | |
Pierce 20x TBS Buffer | Thermo Fisher Scientific | 28358 | |
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23236 | Albumin standard included |
ProLon Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553141 | FcR block |
RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
SpectraMax M5 | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.1 software |
Sterile cell Strainers 100 µM | Fisher Scientific | 22363549 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Vancomycin Hydrochloride | Goldbio | V-200-1 | |
Zombie Aqua | Biolegend | 423102 | fluorescent dye for flow cytometry analysis |