Микродиссекция слоев трехстворчатых клапанных листовок для двухосной механической характеристики и микроструктурной количественной оценки
Summary
Этот протокол описывает двухосную механическую характеристику, поляризованную пространственную частотную обработку коллагена на основе визуализации и микродиссекцию листовок трикуспидального клапана. Представленный метод разъясняет, как слои листовок способствуют целостному поведению листовок.
Abstract
Трикуспидальный клапан (ТВ) регулирует однонаправленный поток неоксигенированной крови из правого предсердия в правый желудочек. Телевизор состоит из трех листовок, каждая из которых имеет уникальное механическое поведение. Эти различия между тремя телевизионными листовками могут быть дополнительно поняты путем изучения их четырех анатомических слоев, которые являются атриальными (A), губчатыми (S), фиброзными (F) и желудочковыми (V). Хотя эти слои присутствуют во всех трех телевизионных листовках, существуют различия в их толщине и микроструктурных составляющих, которые дополнительно влияют на их соответствующее механическое поведение.
Этот протокол включает в себя четыре шага для выяснения различий, специфичных для уровня: (i) охарактеризовать архитектурное поведение механического и коллагенового волокна неповрежденной телевизионной листовки, (ii) разделить составные слои (A / S и F / V) телевизионной листовки, (iii) выполнить те же характеристики для составных слоев и (iv) выполнить пост-hoc оценка гистологии. Эта экспериментальная структура уникально позволяет напрямую сравнивать неповрежденную телевизионную ткань с каждым из ее составных слоев. В результате с помощью этого протокола можно собирать подробную информацию о микроструктуре и биомеханической функции телевизионных листовок. Такая информация потенциально может быть использована для разработки телевизионных вычислительных моделей, которые стремятся обеспечить руководство для клинического лечения телевизионного заболевания.
Introduction
Телевизор расположен между правым предсердием и правым желудочком сердца. На протяжении всего сердечного цикла телевизор регулирует однонаправленный кровоток посредством циклического открытия и закрытия передней листовки телевизора (TVAL), задней листовки TV (TVPL) и телевизионной септальной листовки (TVSL). Эти листочки сложны и имеют четыре отдельных анатомических слоя — атриальный (A), губчатый (S), фиброза (F) и желудочковый (V) — с уникальными микроструктурными компонентами. Волокна эластина в предсердиях и желудочковых помогают восстановить ткань до ее недеформированной геометрии после механической нагрузки1. Напротив, фиброза содержит плотную сеть волнистых коллагеновых волокон, которые способствуют несущей способности листовок2. В основном состоящая из гликозаминогликанов, губчатая оболочка была предложена для обеспечения сдвига между слоями листовок во время функции сердечного клапана3. Хотя все три типа листовок имеют одинаковые анатомические слои, существуют различия в толщине слоев и составляющих соотношениях, которые имеют последствия для механического поведения, специфичного для листовки.
Исследователи изучили свойства телевизионных листовок, используя планарные механические характеристики, гистоморфологические оценки и оптические характеристики архитектуры коллагенового волокна. Например, плоские двухосные механические характеристики стремятся имитировать физиологическую нагрузку путем приложения перпендикулярных перемещений к ткани и регистрации связанных сил. Полученные в результате наблюдения за силовым смещением (или напряжением-растяжением) показали, что все три телевизионные листовки демонстрируют нелинейное, специфичное для направления механическое поведение с более очевидными специфическими реакциями в направлении радиальной ткани 4,5,6. Считается, что такое поведение, специфичное для листовок, связано с различиями в микроструктурных свойствах, наблюдаемых с использованием стандартных гистологических методов 6,7. Кроме того, визуализация второй гармонической генерации6, малоугловое рассеяние света8 и поляризованная пространственная визуализация в частотной области7 (pSFDI) направлены на понимание этих микроструктурных свойств и показали специфические различия в ориентации коллагенового волокна и обжиме волокна, которые имеют последствия для наблюдаемого механического поведения на тканевом уровне. Эти исследования значительно продвинули наше понимание микроструктуры ткани и ее роли в поведении на тканевом уровне. Тем не менее, многое еще предстоит решить в экспериментальном соединении тканевой механики и лежащей в ее основе микроструктуры.
Недавно эта лаборатория выполнила механическую характеристику слоев телевизионных листовок, разделенных на два композитных слоя (A/S и F/V) с использованием метода микродиссекции9. Эта более ранняя работа выявила различия в механических свойствах слоев и помогла понять, как слоистая микроструктура способствует механическому поведению тканей. Хотя это исследование улучшило наше понимание микроструктуры телевизионных листовок, метод имел несколько ограничений. Во-первых, свойства композитных слоев не сравнивались напрямую с интактной тканью, что приводило к отсутствию полного понимания взаимосвязи механика-микроструктура. Во-вторых, архитектура коллагеновых волокон композитных слоев не исследовалась. В-третьих, из-за трудностей со сбором композитных слоев из двух других телевизионных листовок были исследованы только слои TVAL. Способ, описанный в настоящем описании, обеспечивает целостную структуру характеристик, которая преодолевает эти ограничения и обеспечивает полную характеристику телевизионных листовок и их составных слоев.
В этой статье описывается метод микродиссекции, который разделяет три телевизионные листовки на их составные слои (A / S и F / V) для двухосных механических и микроструктурных характеристик 10,11,12. Этот итеративный протокол включает в себя (i) двухосные механические испытания и характеристику pSFDI неповрежденной листовки, (ii) новый и воспроизводимый метод микродиссекции для надежного получения композитных телевизионных слоев и (iii) двухосные механические испытания и характеристику pSFDI композитных телевизионных слоев. Ткань подвергалась двухосной растягивающей нагрузке с различными соотношениями сил для механических испытаний. Затем pSFDI использовался для определения ориентации и выравнивания коллагенового волокна в различных конфигурациях нагрузки. pSFDI сохраняет нативную архитектуру коллагеновых волокон, позволяет проводить анализ в зависимости от нагрузки и обходит типичную необходимость фиксации или очистки ткани для анализа архитектуры коллагеновых волокон, например, при визуализации генерации второй гармоники или рассеянии света под малым углом. Наконец, ткани были подготовлены с использованием стандартных методов гистологии для визуализации микроструктуры ткани. Эта итеративная и целостная структура позволяет напрямую сравнивать механические и микроструктурные свойства телевизионной брошюры с ее составными слоями.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические этапы для протокола включают: (i) микродиссекцию слоя, (ii) крепление ткани, (iii) размещение фидуциального маркера и (iv) установку pSFDI. Микродиссекция соответствующего слоя является наиболее важным и сложным аспектом способа, описанного в настоящем описании. Прежде чем начать р?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Грантом американской кардиологической ассоциации на развитие ученых (16SDG27760143) и Пресвитерианским фондом здоровья. KMC был частично поддержан Программой исследовательских возможностей для студентов Университета Оклахомы (OU) и Программой обучения исследованиям с отличием. DWL был частично поддержан Стипендией Национального научного фонда для аспирантов (GRF 2019254233) и Американской кардиологической ассоциацией / Фондом детского сердца Predoctoral Fellowship (награда No 821298). Вся эта поддержка с благодарностью признается.
Materials
| 10% Formalin Solution, Neutral Buffered | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| Alconox Detergent | Alconox | cleaning compound | |
| BioTester – Biaxial Tester | CellScale Biomaterials Testing | 1.5 N Load Cell Capacity | |
| Cutting Mat | Dahle | B0027RS8DU | |
| Deionized Water | N/A | ||
| Fine-Tipped Tool | HTI INSTRUMENTS | NSPLS-12 | |
| Forceps – Curved | Scientific Labwares | 16122 | |
| Forceps – Thick | Scientific Labwares | 161001078 | |
| Forceps – Thin | Scientific Labwares | 16127 | |
| LabJoy | CellScale Biomaterials Testing | Version 10.66 | |
| Laser Displacement Sensor | Keyence | IL-030 | |
| Liquid Cyanoacrylate Glue | Loctite | 2436365 | |
| MATLAB | MathWorks | Version 2020a | |
| Micro Scissors | HTI Instruments | CAS55C | |
| Pipette | Belmaks | 360758081051Y4 | |
| Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device | N/A | Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details. |
|
| Scalpel | THINKPRICE | TP-SCALPEL-3010 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) | VWR International | H3515541105024 | |
| Surgical Pen | LabAider | LAB-Skin-6 | |
| T-Pins | Business Source | BSN32351 | |
| Wax Board | N/A | Made in-house using modeling wax and baking tray | |
| Weigh Boat | Pure Ponta | mdo-azoc-1030 |
Referências
- Vesely, I. The role of elastin in aortic valve mechanics. Journal of Biomechanics. 31 (2), 115-123 (1998).
- Zhang, W., Ayoub, S., Liao, J., Sacks, M. S. A meso-scale layer-specific structural constitutive model of the mitral heart valve leaflets. Acta Biomaterialia. 32, 238-255 (2016).
- Stella, J. A., Sacks, M. S. On the biaxial mechanical properties of the layers of the aortic valve leaflet. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (5), 757-766 (2007).
- Khoiy, K. A., Amini, R. On the biaxial mechanical response of porcine tricuspid valve leaflets. Journal of Biomechanical Engineering. 138 (10), 104504 (2016).
- Jett, S. V., et al. An investigation of the anisotropic mechanical properties and anatomical structure of porcine atrioventricular heart valves. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 87, 155-171 (2018).
- Meador, W. D., et al. A detailed mechanical and microstructural analysis of ovine tricuspid valve leaflets. Acta Biomaterialia. 102, 100-113 (2020).
- Hudson, L. T., et al. A pilot study on linking tissue mechanics with load-dependent collagen microstructures in porcine tricuspid valve leaflets. Bioengenharia. 7 (2), 60 (2020).
- Pant, A. D., et al. Pressure-induced microstructural changes in porcine tricuspid valve leaflets. Acta Biomaterialia. 67, 248-258 (2018).
- Kramer, K. E., et al. An investigation of layer-specific tissue biomechanics of porcine atrioventricular heart valve leaflets. Acta Biomaterialia. 96, 368-384 (2019).
- Ross, C. J., Laurence, D. W., Wu, Y., Lee, C. -. H. Biaxial mechanical characterizations of atrioventricular heart valves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59170 (2019).
- Goth, W., Lesicko, J., Sacks, M. S., Tunnell, J. W. Optical-based analysis of soft tissue structures. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 357-385 (2016).
- Jett, S. V., et al. Integration of polarized spatial frequency domain imaging (pSFDI) with a biaxial mechanical testing system for quantification of load-dependent collagen architecture in soft collagenous tissues. Acta Biomaterialia. 102, 149-168 (2020).
- Reddy, J. N. . An Introduction to Continuum Mechanics. , (2013).
- Duginski, G. A., Ross, C. J., Laurence, D. W., Johns, C. H., Lee, C. -. H. An investigation of the effect of freezing storage on the biaxial mechanical properties of excised porcine tricuspid valve anterior leaflets. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103438 (2020).
- Salinas, S. D., Clark, M. M., Amini, R. Mechanical response changes in porcine tricuspid valve anterior leaflet under osmotic-induced swelling. Bioengenharia. 6 (3), 70 (2019).
- Pokutta-Paskaleva, A., Sulejmani, F., DelRocini, M., Sun, W. Comparative mechanical, morphological, and microstructural characterization of porcine mitral and tricuspid leaflets and chordae tendineae. Acta Biomaterialia. 85, 241-252 (2019).
- Ross, C. J., et al. An investigation of the glycosaminoglycan contribution to biaxial mechanical behaviors of porcine atrioventricular heart valve leaflets. Journal of the Royal Society Interface. 16 (156), 0069 (2019).
- Sommer, G., Regitnig, P., Költringer, L., Holzapfel, G. A. Biaxial mechanical properties of intact and layer-dissected human carotid arteries at physiological and supraphysiological loadings. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (3), 898-912 (2009).
- Holzapfel, G. A., Sommer, G., Gasser, C., Regitnig, P. Determination of the layer-specific mechanical properties ofhuman coronary arteries with intimal thickening, and related constitutive modelling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (5), 2048-2058 (2005).
- Sommer, G., et al. Multiaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).
