TGT overflade er en innovativ platform til at studere vækstfaktor-integrin crosstalk. Det fleksible sondedesign, vedhæftningsligandens specificitet og præcise modulering af stimuleringsbetingelser muliggør robuste kvantitative vurderinger af EGFR-integrin-samspil. Resultaterne fremhæver EGFR som en ‘mechano-organizer’ tuning integrin mekanik, der påvirker fokal vedhæftningssamling og cellespredning.
Multicellulære organismer er afhængige af interaktioner mellem membranreceptorer og beslægtede ligander i den omgivende ekstracellulære matrix (ECM) for at orkestrere flere funktioner, herunder adhæsion, proliferation, migration og differentiering. Mekaniske kræfter kan overføres fra cellen via adhæsionsreceptorintegrin til ligander i ECM. Mængden og den rumlige organisering af disse cellegenererede kræfter kan moduleres af vækstfaktorreceptorer, herunder epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR). De værktøjer, der i øjeblikket er tilgængelige til at kvantificere krydstalemedierede ændringer i cellemekanik og relatere dem til fokale adhæsioner, cellulær morfologi og signalering, er begrænsede. DNA-baserede molekylære kraftsensorer kendt som spændingsmålerbindinger (TGT’er) er blevet anvendt til at kvantificere disse ændringer. TGT-sonder er unikke i deres evne til både at modulere den underliggende krafttærskel og rapportere piconewtonskalareceptorkræfter over hele den vedhængende celleoverflade ved diffraktionsbegrænset rumlig opløsning. TGT-sonderne, der anvendes her, er afhængige af den irreversible dissociation af en DNA-duplex af receptor-ligandkræfter, der genererer et fluorescerende signal. Dette muliggør kvantificering af cellens kumulative integrinspænding (krafthistorie). Denne artikel beskriver en protokol, der anvender TGT’er til at studere virkningen af EGFR på integrinmekanik og vedhæftningsdannelse. Samlingen af den mekaniske TGT-sensorplatform er systematisk detaljeret, og proceduren for billedkræfter, fokale adhæsioner og cellespredning er skitseret. Samlet set gør evnen til at modulere sondens underliggende krafttærskel, adhæsionsliganden og typen og koncentrationen af vækstfaktor, der anvendes til stimulering, dette til en robust platform til undersøgelse af samspillet mellem forskellige membranreceptorer i regulering af integrinmedierede kræfter.
Celler har den iboende evne til at sanse, generere og reagere på mekaniske kræfter, hvilket fører til ændringer i cellulær fænotype og ombygning af det lokale mikromiljø 1,2. Kræfter spiller en afgørende rolle i reguleringen af mange aspekter af celleadfærd, herunder adhæsion, migration, spredning, differentiering og sårheling 3,4. Afvigelser i den tovejs mekaniske udveksling mellem en celle og mikromiljøet kan føre til syge tilstande, herunder kræft5. Talrige membranreceptorer er involveret i opretholdelse af cellematrixhomeostase; af disse har integriner og epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) robust synergi 6,7. Klassisk etablerer integriner den mekaniske forbindelse mellem mikromiljøet og intracellulært cytoskelet, mens EGFR regulerer cellevækst, proliferation og overlevelse 8,9. EGFR er et højt undersøgt terapeutisk mål, der fokuserer på udefra-ind-regulering, der letter intracellulær signalering. EGFR-integrin crosstalk er blevet etableret genetisk og biokemisk for at regulere udviklingen af flere sygdomme, herunder kræft10,11. Mens undersøgelser indikerer eksistensen af EGFR-integrin-samspil, tilskrives resultaterne signalveje væk fra plasmamembranen 7,12,13,14. Virkningen af EGFR eller andre vækstfaktorer på cellemekanik forbliver stort set uudforsket delvis på grund af manglen på værktøjer til måling af cellulære kræfter og signalresultater. Udfordringen ligger i at identificere passende værktøjer til at studere kommunikationen mellem disse parallelle signalparadigmer og kvantificere deres specifikke bidrag til cellemekanik.
Flere tilgange er blevet udviklet til at måle kræfter genereret af celleadhæsionsreceptorer, og læseren henvises til dybdegående gennemgang af disse teknikker15,16. Kort fortalt er trækkraftmikroskopi og mikrosøjlearraydetektion afhængig af deformation af et underliggende substrat for at udlede nanonewton (nN) kræfter, en størrelsesorden mere end individuelle receptorkræfter17,18. Enkeltmolekyleteknikker, herunder AFM og optisk pincet, er følsomme over for enkeltprotein piconewton (pN) kræfter, men måler kun en receptor ad gangen og tilbyder ikke god (eller nogen) rumlig opløsning. DNA-baserede molekylære spændingssonder og spændingsmåler tether (TGT) sonder tilbyder pN-kraftopløsning med diffraktionsbegrænset (eller bedre) rumlig opløsning, hvilket giver dem en unik rolle i studiet af enkeltcellekræfter 19,20 fra forskellige celletyper, herunder fibroblaster, kræftceller, blodplader og immunceller 21,22,23,24 . Mens molekylære spændingssonder har et udvideligt “fjeder” -element, ideelt til billeddannelse i realtid, brister TGT-sonder irreversibelt og efterlader en fluorescerende “krafthistorie”. TGT’er modulerer desuden spændingstærsklen for det underliggende substrat; en række sonder med lignende kemiske sammensætninger, men forskellige brudkræfter eller spændingstolerancer (T tol), kan brugestil at kvantificere den minimale spænding, der kræves til fokal vedhæftningsdannelse og cellespredning. TGT-sonder består af to komplementære DNA-strenge, den ene forankret til overfladen og den anden præsenterer en ligand for cellen. Hvis en receptor binder liganden og udøver en kraft større end sondensT-tol, adskilles trådene. Ttol defineres som den konstante kraft, der er nødvendig for at briste 50% af sonderne i et 2 s interval under ideelle forhold. I “turn-on” TGT-sonder kan en quencher på den øverste streng adskilles fra en fluorofor på bundstrengen. Kun hvor TGT-sonden er blevet brudt, formodentlig med kræfter større end eller lig med Ttol, vil der blive genereret et fluorescerende signal. TGT-sonder kan også fastgøres, hvilket giver mulighed for nem manipulation af biologiske systemer og test af flere forhold. Af disse grunde blev TGT-sonder anvendt i dette arbejde.
TGT-sonder blev anvendt til at undersøge, hvordan integrinafhængig celleadhæsion og mekaniske kræfter moduleres af aktiveret EGFR21. Dette arbejde etablerede EGFR som en ‘mechano-organisator’, tuning fokal vedhæftningsorganisation og spændingsgenerering. Derudover blev det konstateret, at EGF-stimulering påvirkede fordelingen og modenheden af fokale adhæsioner og forbedret cellespredning. Denne tilgang kan bruges i fremtidige undersøgelser til at undersøge, hvordan vækstfaktorer påvirker mekaniske kræfter i tumorprogression og dynamik. Mens EGFR-integrin-krydstales rolle i reguleringen af epitelet til mesenkymal overgang er etableret, forbliver de mekaniske kræfters rolle i denne proces underudforsket10.
Her præsenteres en detaljeret protokol for disse eksperimenter, der dækker syntese og samling af 56 pN TGT-sonder, generering af TGT-overflader på glasdæksler, anvendelse af Cos-7-celler på TGT-overfladen og stimulering med EGF, fiksering og farvning af celler med phalloidin og et anti-paxillin-antistof, højopløsnings total intern refleksionsfluorescens (TIRF) og refleksionsinterferenskontrastmikroskopi (RICM) billeddannelse, og billedkvantificering. Denne protokol, selvom den er skrevet for at undersøge EGF-stimulering af Cos-7-celler, kan let tilpasses til mange TGT-baserede eksperimenter. Forskellige ligander,T-tol, celletyper, stimuleringsparametre, proteiner mærket efter fiksering og kvantitativ analyse kan let erstattes i, hvilket gør denne protokol robust og meget nyttig.
Med den detaljerede trinvise procedure, der er beskrevet ovenfor, kan man forberede TGT-overflader til at kvantificere cellemorfologi og integrinspænding genereret af vedhængende celler under cellefastgørelse og spredning efter behandling med EGF. Det enkle sondedesign og syntese og overfladebehandling sammen med den enkle eksperimentelle opsætning gav en stabil platform til at studere interaktionen mellem EGFR og integriner. Samlet set validerer resultaterne, at ligandafhængig aktivering af EGFR forbedrer cellespredning, indstiller de kraftbærende egenskaber af integrinreceptorer og fremmer fokal vedhæftningsorganisation og modning. Resultaterne opnået ved hjælp af TGT-sonder understøtter den overordnede hypotese om, at vækstfaktorer, såsom EGFR, fungerer som ‘mekano-arrangører’, hvilket øger mængden og den rumlige organisering af integrinspænding og regulerer orienteringen og mekanikken af fokale adhæsioner.
Ved påføring på TGT-overfladen lander cellerne, binder og spredes, når integrinreceptorerne (αVβ3) sanser og binder til cRGDfK-liganden. Dermed kan TGT-sonderne brydes mekanisk og generere fluorescens på stedet for ligandindgreb. Udlæsningen er den kumulative “krafthistorie” for cellen, der interagerer med overfladen. Der er nogle almindelige problemer med TGT-overfladerne, der kan være til stede under disse eksperimenter. Høj overfladebaggrundsfluorescens (figur 6A, B), ujævn overfladeudseende, cellernes manglende evne til at generere spændingssignal (figur 6C, D) og manglende spredning af celler (figur 6E, F) kan skyldes tekniske mangler med TGT-sonden eller overfladesyntesen. Løsninger på disse fælles problemer fremgår af tabel 1.
Det enkle design af TGT-sonder giver cellebiologer et kraftfuldt værktøj til at studere specifikke vækstfaktor-integrin-signalresultater isoleret uden interferens fra andre celleoverfladereceptorer ved kun at tilvejebringe specifikke ligander og stimuleringer. Derudover tillader TGT-sonder undersøgelse af spændingstærsklen, der understreger individuelle integrinreceptorer under celleadhæsion ved pN-følsomhed. Alternative tilgange rapporterer ikke kræfter udøvet af individuelle receptorer med høj rumlig opløsning i faste prøver31. Traktionskraftmikroskopi er kun følsom over for nN-kræfter, en størrelsesorden højere end de kræfter, der påføres af individuelle integrinreceptorer15, og molekylære spændingssonder måler pN-kræfter, men fordi de er reversible, modstår de ikke robust fiksering. Af disse grunde er TGT-sonder et attraktivt værktøj til at studere mekanikken i vækstfaktor-integrin-interaktioner.
Der er flere tekniske nuancer forbundet med TGT-sonder, der bør overvejes, før man designer et eksperiment. Spændingsbilledet er et øjebliksbillede, der repræsenterer krafthistorikken og ikke en indikator for receptor-ligand-engagementerne på et givet tidspunkt. Da signalgenerering er afhængig af sondeseparation, skyldes TGT-fluorescensen åbne sonder, der ikke er under aktiv spænding fra receptor-ligandinddragelse. Dette betyder, at aflæsningen for integrinspænding opnået på TGT-overfladen er historisk og kumulativ i naturen, der repræsenterer, hvor der var kræfter større end Ttol; placeringen af aktuelle receptorligandkræfter mindre end Ttol rapporteres ikke19,32. Fordi TGT-brud resulterer i afslutning af receptor-ligandinddragelsen, skyldes cellespredning integrin-ligandinteraktioner, der oplever kræfter lavere endT-tol. Brugeren skal derfor være forsigtig, når han definerer tiden efter plettering for at estimere de mekaniske resultater forbundet med integrinbaserede adhæsioner. Endelig skal betydningen af Ttol overvejes. De TGT-sonder, der anvendes her, har enT-tol på 56 pN, hvor Ttol er den konstante kraft, der er nødvendig for at sprænge 50% af sonderne, når de påføres 2 s. Når man overvejer komplicerede biologiske systemer, oplever TGT’er sandsynligvis en heterogen og forskelligartet kraftgradering med varierende tidsafhængigheder. Hvis TGT’er brydes af kræfter større end Ttol, ville fluorescensen være en undervurdering af den samlede spænding. Alternativt kan kræfter underT-tol anvendt i længere varigheder sprænge et tilsvarende antal sonder som høje tærskelkræfter anvendt i kortere tid. Begge disse scenarier kan resultere i den samme fluorescensintensitetsudlæsning, hvilket gør det vanskeligt at løse den nøjagtige spændingsstørrelse eller dynamik ved hjælp af TGT-sonder33,34.
Samlet set bør vurderinger af integrinspænding med vækstfaktorstimulering foretages omhyggeligt ved at designe eksperimenter med interne kontroller, sammenligne spredningsprofiler på andre matrixbelagte overflader, foretage parallelle vurderinger af TGT-fluorescens i celler i nærvær eller fravær af vækstfaktorstimulering og anvende TGT’er med forskelligeT-tol . TGT’er tillader kvantificering af vækstfaktorsignaleringens rolle i reguleringen af integrinreceptorernes mekanik, fokal adhæsionsdynamik og cellespredning. Denne protokol kan bruges som skabelon til mange TGT-baserede eksperimenter ved hjælp af sonder med forskelligeT-tol, forskellige ligander, forskellige celletyper eller forskellige stimuleringsbetingelser. Eventuelle proteiner af interesse kan mærkes efter fiksering, og enhver form for kvantitativ billedanalyse kan implementeres. Som sådan præsenterer vi en skabelon til adskillige TGT-eksperimenter.
Brugen af TGT-sonder er ikke begrænset til at studere integriner, men kan udvides til en bred vifte af cellemembranreceptorer på tværs af forskellige celletyper ved at modificere liganden. TGT-sonder er blevet brugt til at undersøge kræfternes rolle i reguleringen af forskellige receptorsignalkaskader, herunder identifikation af Notch-receptormekanikkens mekaniske rolle i embryonal udvikling og neurogenese35, de kræfter, der formidler identifikation og internalisering af antigener af B-cellereceptorer36, og T-celleoverfladereceptorernes mekaniske korrekturlæsningsevne til at detektere ændringer i kræfter for at øge styrken og specificiteten af signaloverførsel37 . Tilsammen fremhæver disse resultater det enorme potentiale i TGT-sonder i en række eksperimentelle indstillinger.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende medlemmerne af Mattheyses laboratorium for frugtbare diskussioner og kritik. Vi anerkender finansiering til A.L.M. fra NSF CAREER 1832100 og NIH R01GM131099.
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Millipore Sigma | 440140 | Surface Preparation |
3-hydroxypicolinic acid (3-HPA) | Millipore Sigma | 56197 | Maldi-TOF-MS matrix |
Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | A38S | Diluting EGF |
Acetonitrile (HPLC) | Fisher Scientific | A998SK | Oligonucleotide Preparation |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Cell Signaling Technology | 8878S | Immunocytochemistry |
Ammonium Chloride | Fisher Scientific | A687 | Immunocytochemistry |
Anti-Paxillin antibody [Y113] | Abcam | ab32084 | Immunocytochemistry |
BD Syringes only with Luer-Lok | BD bioscience | 309657 | Surface Preparation |
Bio-Gel P-2 | Bio-Rad | 1504118 | Oligonucleotide Preparation |
Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | Surface Preparation |
Cos-7 cells | ATCC | CRL-1651 | Cell Culture, Passage numbers 11-20 |
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips | Fisher Scientific | C14784 | Surface Preparation |
c(RGDfK(PEG-PEG)), PEG=8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid | Vivitide | PCI-3696-PI | Oligonucleotide Preparation |
Cy3B NHS ester | GE Healthcare | PA63101 | Oligonucleotide Preparation |
Dimethylformamide | Millipore Sigma | PHR1553 | Oligonucleotide Preparation |
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013C | Cell Culture |
Epidermal Growth Factor human EGF | Millipore Sigma | E9644 | Cell Culture |
Ethanol, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22032601 | Surface Preparation |
Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08-772E | Surface Preparation |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10-438-026 | Cell Culture |
Flurobrite DMEM | Fisher Scientific | A1896701 | Cell Culture |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21244 | Immunocytochemistry |
Goat Serum | Fisher Scientific | 16-210-064 | Immunocytochemistry |
Hank’s balanced salts (HBSS) | Fisher Scientific | 14-170-161 | Cell Culture |
Horse Serum | Fisher Scientific | 16050130 | Immunocytochemistry |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-500 | Surface Preparation |
Nanosep MF centrifugal devices | Pall laboratory | ODM02C35 | Oligonucleotide Preparation |
NHS-azide | Fisher Scientific | 88902 | Oligonucleotide Preparation |
Nitrogen Gas Cylinder | Airgas | Surface Preparation | |
No. 2 round glass coverslips – 25 mm | VWR | 48382-085 | Surface Preparation |
Parafilm M Laboratory Film | Fisher Scientific | 13-374-10 | Surface Preparation |
Paraformaldehyde 16% | Fisher Scientific | 50-980-487 | Immunocytochemistry |
PBS, 1X | Fisher Scientific | 21-030-CV | Surface Preparation/Immunocytochemistry |
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15-070-063 | Cell Culture |
PYREX Low Form Griffin Beakers | Fisher Scientific | 02-540G | Surface Preparation |
Sodium Ascorbate | Fisher Scientific | 18-606-310 | Oligonucleotide Preparation |
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | Oligonucleotide Preparation |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | Surface Preparation |
Streptavidin | Fisher Scientific | 434301 | Surface Preparation |
Sulfo-NHS-LC-Biotin | Fisher Scientific | 21335 | Surface Preparation |
Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300-500 | Surface Preparation |
TEAA | Fisher Scientific | NC0322726 | Oligonucleotide Preparation |
Triethylamine | Millipore Sigma | 471283 | Oligonucleotide Preparation |
Trifluoroacetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28901 | Oligonucleotide Preparation |
THPTA | Fisher Scientific | NC1296293 | Oligonucleotide Preparation |
Triton X 100 Detergent Surfact Ams Solution | Fisher Scientific | 85111 | Immunocytochemistry |
Water, DNA Grade, DNASE, Protease free | Fisher Scientific | BP24701 | Oligonucleotide Preparation |
Equipment | |||
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm | Agilent | 653950-702 | Oligonucleotide Preparation |
High-performance liquid chromatography | Agilent | 1100 | Oligonucleotide Preparation |
Low Speed Orbital Shaker | Fisher Scientific | 10-320-813 | Immunocytochemistry |
Matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS) | Voyager STR | Oligonucleotide Preparation | |
Molecular Probes Attofluor Cell Chamber | Fisher Scientific | A7816 | Surface Preparation |
Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher | Oligonucleotide Preparation | |
Nikon Eclipse Ti inverted microscope | pe Nikon | Microscopy | |
Nikon Perfect Focus System | Nikon | Microscopy | |
NIS Elements software | Nikon | Microscopy | |
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | Microscopy | |
Quad band TIRF 405/488/561/647 cube | CHROMA | Microscopy | |
RICM Cube | CHROMA | Microscopy | |
SOLA v-nIR Light Engine | Lumencor | Microscopy | |
Thermo Forma Steri Cycle 370 CO2 Incubator | Fisher Scientific | Cell Culture | |
VWR 75D Ultrasonic Cleaner | VWR | 13710 | Surface Preparation |
Data Analysis | Use | ||
Fiji (Image J) | https://imagej.net/software/fiji/downloads | Quantitative Analysis | |
Graph Pad Prism | Graph Pad | Statistical Analysis | |
Oligo name | 5'modification/ 3' modification | Sequence (5' to 3') | Use |
Alkyne-21-BHQ2 | 5' Hexynyl/ 3' BHQ_2 | GTGAAATACCGCACAGATGCG | Top strand TGT probe |
56 pN TGT | 5' Biosg/TTTTTT/iUniAmM | CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT | Bottom strand TGT probe |
12 pN TGT | 5' AmMC6/ 3' BioTEG | CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT | Bottom strand TGT probe |