TGT overflate er en innovativ plattform for å studere vekstfaktor-integrin crosstalk. Den fleksible sondedesignen, spesifisiteten til adhesjonsligaden og presis modulering av stimuleringsforhold tillater robuste kvantitative vurderinger av EGFR-integrinsk samspill. Resultatene fremhever EGFR som en ‘mechano-arrangør’ tuning integrin mekanikk, påvirker fokal vedheft montering og celle spredning.
Multicellulære organismer er avhengige av interaksjoner mellom membranreseptorer og konjakkligner i den omkringliggende ekstracellulære matrisen (ECM) for å orkestrere flere funksjoner, inkludert vedheft, spredning, migrasjon og differensiering. Mekaniske krefter kan overføres fra cellen via vedheftsreseptoren integrin til ligander i ECM. Mengden og romlig organisering av disse cellegenererte kreftene kan moduleres av vekstfaktorreseptorer, inkludert epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR). Verktøyene som for tiden er tilgjengelige for å kvantifisere krysstalemediert endring i cellemekanikk og relatere dem til fokusadhesjoner, cellulær morfologi og signalering er begrenset. DNA-baserte molekylære kraftsensorer kjent som spenningsmålerte tthers (TGTs) har blitt brukt til å kvantifisere disse endringene. TGT-sonder er unike i deres evne til både å modulere den underliggende kraftterskelen og rapportere piconewton-skalareseptorkrefter over hele den tilhengercelleoverflaten ved diffraksjonsbegrenset romlig oppløsning. TGT-sondene som brukes her, er avhengige av den irreversible dissosiasjonen av et DNA-dupleks av reseptor-ligandkrefter som genererer et fluorescerende signal. Dette tillater kvantifisering av cellens kumulative integrinske spenning (krafthistorikk). Denne artikkelen beskriver en protokoll som benytter TGTs for å studere effekten av EGFR på integrinsk mekanikk og vedheftsdannelse. Monteringen av TGT mekanisk sensorplattform er systematisk detaljert og prosedyren for bildekrefter, brennvidde og cellespredning er skissert. Samlet sett gjør evnen til å modulere sondens underliggende kraftterskel, vedheftsligen og typen og konsentrasjonen av vekstfaktor som brukes til stimulering dette til en robust plattform for å studere samspillet mellom ulike membranreseptorer i regulering av integrinmediede krefter.
Celler har den iboende evnen til å føle, generere og reagere på mekaniske krefter, noe som fører til endringer i cellulær fenotype og ombygging av det lokale mikromiljøet 1,2. Krefter spiller en avgjørende rolle i å regulere mange aspekter av celleadferd, inkludert vedheft, migrasjon, spredning, differensiering og sårheling 3,4. Avvik i den toveis mekaniske utvekslingen mellom en celle og mikromiljøet kan føre til syke tilstander, inkludert kreft5. Tallrike membranreseptorer er involvert i å opprettholde cellematrise homeostase; av disse har integriner og epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) robust synergi 6,7. Klassisk etablerer integriner den mekaniske forbindelsen mellom mikromiljøet og intracellulært cytoskjelett, mens EGFR regulerer cellevekst, spredning og overlevelse 8,9. EGFR er et høyt studert terapeutisk mål, fokusert på utenfor-in regulering som letter intracellulær signalering. EGFR-integrinsk krysstale er etablert genetisk og biokjemisk for å regulere utviklingen av flere sykdommer, inkludert kreft10,11. Mens studier indikerer eksistensen av EGFR-integrinsk samspill, tilskrives resultatene signalveier bort fra plasmamembranen 7,12,13,14. Virkningen av EGFR, eller andre vekstfaktorer, på cellemekanikk forblir i stor grad uutforsket delvis på grunn av mangel på verktøy for å måle cellulære krefter og signalresultater. Utfordringen ligger i å identifisere passende verktøy for å studere kommunikasjonen mellom disse parallelle signalparadigmene og å kvantifisere deres spesifikke bidrag til cellemekanikk.
Flere tilnærminger er utviklet for å måle krefter generert av celleadhesjonsreseptorer, og leseren er rettet mot grundige vurderinger av disse teknikkene15,16. Kort sagt, trekkraft mikroskopi og mikro-søyle array deteksjon er avhengig av deformasjon av et underliggende substrat for å utlede nanonewton (nN) krefter, en størrelsesorden mer enn individuelle reseptorkrefter 17,18. Enkeltmolekylteknikker, inkludert AFM og optisk pinsett, er følsomme for enkeltprotein piconewton (pN) krefter, men måler bare en reseptor om gangen og tilbyr ikke god (eller noen) romlig oppløsning. DNA-baserte molekylære spenningssonder og spenningsmåler-tether (TGT)-sonder tilbyr pN-kraftoppløsning med diffraksjonsbegrenset (eller bedre) romlig oppløsning, noe som gir dem en unik rolle i å studere encellede krefter19,20 fra forskjellige celletyper, inkludert fibroblaster, kreftceller, blodplater og immunceller 21,22,23,24 . Mens molekylære spenningssonder har et uttrekkbart “fjær” -element, ideelt for sanntidsavbildning, bryter TGT irreversibelt, og etterlater seg en fluorescerende “krafthistorie”. TGTer modulerer i tillegg spenningsterskelen til det underliggende substratet; en rekke sonder med lignende kjemiske sammensetninger, men forskjellige bruddkrefter, eller spenningstoleranser (T-tol), kan brukes til å kvantifisere minimumsspenningen som kreves for brennviddedannelse og cellespredning. TGT-sonder består av to komplementære DNA-tråder, den ene forankret til overflaten og den andre presenterer en ligand til cellen. Hvis en reseptor binder liganden og utøver en kraft som er større enn sondensT-tol, vil trådene bli skilt. Ttol er definert som den konstante kraften som trengs for å sprekke 50% av sondene i et intervall på 2 s under ideelle forhold. I “turn-on” TGT-sonder kan en quencher på toppstrengen skilles fra en fluorofor på bunnstrengen. Bare der TGT-sonden har blitt revet, antagelig av krefter større enn eller likT-tol, vil det genereres et fluorescerende signal. TGT-sonder kan også festes, noe som muliggjør enkel manipulering av biologiske systemer og testing av flere forhold. Av disse grunnene ble TGT-sonder brukt i dette arbeidet.
TGT-sonder ble brukt til å studere hvordan integrinavhengig celleadhesjon og mekaniske krefter moduleres ved aktivert EGFR21. Dette arbeidet etablerte EGFR som en ‘mechano-arrangør’, tuning focal adhesion organisasjon og spenningsgenerering. I tillegg ble det funnet at EGF-stimulering påvirket fordelingen og modenheten til fokale vedheft og forbedret cellespredning. Denne tilnærmingen kan brukes i fremtidige studier for å undersøke hvordan vekstfaktorer påvirker mekaniske krefter i tumorprogresjon og dynamikk. Mens rollen som EGFR-integrinsk krysstale i reguleringen av epitelet til mesenchymal overgang er etablert, forblir rollen som mekaniske krefter i denne prosessen underutredet10.
Her presenteres en detaljert protokoll for disse eksperimentene som dekker syntesen og monteringen av 56 pN TGT-sonder, generering av TGT-overflater på glassdeksler, påføring av Cos-7-celler på TGT-overflaten og stimulering med EGF, fiksering og farging av celler med falloidin, og et anti-paxillin-antistoff, total intern refleksjonsfluorescens med høy oppløsning (TIRF) og refleksjonsforstyrrelser kontrastmikroskopi (RICM) avbildning, og bilde kvantifisering. Denne protokollen, selv om den er skrevet for å undersøke EGF-stimulering av Cos-7-celler, er lett tilpasningsdyktig for mange TGT-baserte eksperimenter. Ulike ligander,T-tol, celletyper, stimuleringsparametere, proteiner merket etter fiksering, og kvantitativ analyse kan enkelt erstattes i, noe som gjør denne protokollen robust og mye nyttig.
Med den detaljerte trinnvise prosedyren som er skissert ovenfor, kan man forberede TGT-overflater for å kvantifisere cellemorfologi og integrinspenning generert av tilhengerceller under cellevedlegg og spredning etter behandling med EGF. Den enkle sondedesignen og syntesen og overflateforberedelsene sammen med det enkle eksperimentelle oppsettet ga en stabil plattform for å studere samspillet mellom EGFR og integrins. Samlet sett validerer resultatene at ligandavhengig aktivering av EGFR forbedrer cellespredning, justerer de kraftbærende egenskapene til integrinske reseptorer og fremmer fokal vedheftsorganisasjon og modning. Resultatene som oppnås ved hjelp av TGT-sonder støtter den overordnede hypotesen om at vekstfaktorer, som EGFR, fungerer som “mekano-arrangører”, øker mengden og romlig organisering av integrinspenning og regulerer orienteringen og mekanikken til fokale vedheft.
Ved påføring på TGT-overflaten lander, fester og sprer cellene seg som de integrinske (αVβ3) reseptorene sanser og binder seg til cRGDfK-liganden. Ved å gjøre det kan TGT-sondene brytes mekanisk, noe som genererer fluorescens på stedet for ligandengasjement. Avlesningen er den kumulative “krafthistorikken” til cellen som samhandler med overflaten. Det er noen vanlige problemer med TGT-overflatene som kan være til stede under disse eksperimentene. Fluorescens med høy overflatebakgrunn (figur 6A,B), lappete overflateutseende, svikt i cellene for å generere spenningssignal (figur 6C, D) og svikt i celler som skal spres (figur 6E,F) kan skyldes tekniske mangler ved TGT-sonden eller overflatesyntesen. Løsninger på disse vanlige problemene er presentert i tabell 1.
Den enkle utformingen av TGT-sonder gir cellebiologer et kraftig verktøy for å studere spesifikke vekstfaktorintegrinske signalresultater isolert uten forstyrrelser fra andre celleoverflatereseptorer ved å bare gi spesifikke ligander og stimuleringer. I tillegg tillater TGT-sonder undersøkelse av spenningsterskelen som understreker individuelle integrinreseptorer under celleadhesjon ved pN-følsomhet. Alternative tilnærminger klarer ikke å rapportere krefter som utøves av individuelle reseptorer med høy romlig oppløsning i faste prøver31. Trekkraftmikroskopi er bare følsom for nN-krefter, en størrelsesorden høyere enn kreftene som brukes av individuelle integrinreseptorer15, og molekylære spenningssonder måler pN-krefter, men fordi de er reversible, tåler de ikke robust fiksering. Av disse grunnene er TGT-sonder et attraktivt verktøy for å studere mekanikken til vekstfaktorintegrininteraksjoner.
Det er flere tekniske nyanser knyttet til TGT-sonder som bør vurderes før du designer et eksperiment. Spenningsbildet er et øyeblikksbilde i tid, som representerer krafthistorikken og ikke en indikator på reseptor-ligand-engasjementene til enhver tid. Siden signalgenerering er avhengig av sondeseparasjon, er TGT-fluorescens et resultat av åpne sonder som ikke er under aktiv spenning fra reseptorligament. Dette betyr at avlesningen for integrinsk spenning oppnådd på TGT-overflaten er historisk og kumulativ i naturen som representerer hvor det var krefter større ennT-tol; plasseringen av nåværende reseptor-ligand krefter mindre enn Ttol er ikke rapportert19,32. Fordi TGT-brudd resulterer i avslutning av reseptor-ligand-engasjementet, skyldes cellespredning integrin-ligand interaksjoner som opplever krefter lavere ennT-tol. Brukeren må derfor være forsiktig når han eller hun definerer tiden etter plating for å estimere de mekaniske resultatene forbundet med integrinbaserte vedheft. Til slutt må betydningen avT-tol vurderes. TGT-sondene som brukes her har enT-tol på 56 pN, hvorT-tol er den konstante kraften som trengs for å briste 50% av sondene når de påføres i 2 s. Når du vurderer kompliserte biologiske systemer, opplever TGTs sannsynligvis en heterogen og mangfoldig kraftgradering med varierende tidsavhengigheter. Hvis TGTs er sprukket av krefter større ennT-tol, vil fluorescensen være en underestimering av den totale spenningen. Alternativt kan krefter underT-tol som brukes i lengre varigheter, sprekke et lignende antall sonder som høye terskelkrefter som brukes i kortere tider. Begge disse scenariene kan resultere i samme fluorescensintensitetsavlesning, noe som gjør det vanskelig å løse den nøyaktige spenningsstyrken eller dynamikken ved hjelp av TGT-sonder33,34.
Samlet sett bør vurderinger av integrin spenning med vekstfaktorstimulering gjøres nøye ved å designe eksperimenter med interne kontroller, sammenligne spredningsprofiler på andre matrisebelagte overflater, gjøre parallelle vurderinger av TGT-fluorescens i celler i nærvær eller fravær av vekstfaktorstimulering, og bruke TGTs med forskjellige Ttol . TGTs tillater kvantifisering av rollen som vekstfaktorsignalering i regulering av mekanikken til integrinreseptorer, fokal vedheftsdynamikk og cellespredning. Denne protokollen kan brukes som en mal for mange TGT-baserte eksperimenter ved hjelp av sonder med forskjelligT-tol, forskjellige ligander, forskjellige celletyper eller forskjellige stimuleringsforhold. Eventuelle proteiner av interesse kan merkes etter fiksering, og enhver type kvantitativ bildeanalyse kan implementeres. Som sådan presenterer vi en mal for mange TGT-eksperimenter.
Bruken av TGT-sonder er ikke begrenset til å studere integriner, men kan utvides til et mangfoldig utvalg av cellemembranreseptorer på tvers av forskjellige celletyper ved å endre liganden. TGT-sonder har blitt brukt til å undersøke kreftenes rolle i å regulere ulike reseptorsignalerende kaskader, inkludert å identifisere den mekaniske rollen til Notch-reseptormekanikk i embryonisk utvikling og nevrogenese35, kreftene som formidler identifisering og internalisering av antigener av B-cellereseptorer36, og den mekaniske bevislesingsevnen til T-celleoverflatereseptorer for å oppdage endringer i krefter for å øke styrken og spesifisiteten til signaloverføring37 . Sammen fremhever disse funnene det enorme potensialet til TGT-sonder i en rekke eksperimentelle innstillinger.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å anerkjenne medlemmene av Mattheyses-laboratoriet for fruktbare diskusjoner og kritikker. Vi erkjenner finansiering til A.L.M. fra NSF CAREER 1832100 og NIH R01GM131099.
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Millipore Sigma | 440140 | Surface Preparation |
3-hydroxypicolinic acid (3-HPA) | Millipore Sigma | 56197 | Maldi-TOF-MS matrix |
Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | A38S | Diluting EGF |
Acetonitrile (HPLC) | Fisher Scientific | A998SK | Oligonucleotide Preparation |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Cell Signaling Technology | 8878S | Immunocytochemistry |
Ammonium Chloride | Fisher Scientific | A687 | Immunocytochemistry |
Anti-Paxillin antibody [Y113] | Abcam | ab32084 | Immunocytochemistry |
BD Syringes only with Luer-Lok | BD bioscience | 309657 | Surface Preparation |
Bio-Gel P-2 | Bio-Rad | 1504118 | Oligonucleotide Preparation |
Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | Surface Preparation |
Cos-7 cells | ATCC | CRL-1651 | Cell Culture, Passage numbers 11-20 |
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips | Fisher Scientific | C14784 | Surface Preparation |
c(RGDfK(PEG-PEG)), PEG=8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid | Vivitide | PCI-3696-PI | Oligonucleotide Preparation |
Cy3B NHS ester | GE Healthcare | PA63101 | Oligonucleotide Preparation |
Dimethylformamide | Millipore Sigma | PHR1553 | Oligonucleotide Preparation |
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013C | Cell Culture |
Epidermal Growth Factor human EGF | Millipore Sigma | E9644 | Cell Culture |
Ethanol, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22032601 | Surface Preparation |
Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08-772E | Surface Preparation |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10-438-026 | Cell Culture |
Flurobrite DMEM | Fisher Scientific | A1896701 | Cell Culture |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21244 | Immunocytochemistry |
Goat Serum | Fisher Scientific | 16-210-064 | Immunocytochemistry |
Hank’s balanced salts (HBSS) | Fisher Scientific | 14-170-161 | Cell Culture |
Horse Serum | Fisher Scientific | 16050130 | Immunocytochemistry |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-500 | Surface Preparation |
Nanosep MF centrifugal devices | Pall laboratory | ODM02C35 | Oligonucleotide Preparation |
NHS-azide | Fisher Scientific | 88902 | Oligonucleotide Preparation |
Nitrogen Gas Cylinder | Airgas | Surface Preparation | |
No. 2 round glass coverslips – 25 mm | VWR | 48382-085 | Surface Preparation |
Parafilm M Laboratory Film | Fisher Scientific | 13-374-10 | Surface Preparation |
Paraformaldehyde 16% | Fisher Scientific | 50-980-487 | Immunocytochemistry |
PBS, 1X | Fisher Scientific | 21-030-CV | Surface Preparation/Immunocytochemistry |
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15-070-063 | Cell Culture |
PYREX Low Form Griffin Beakers | Fisher Scientific | 02-540G | Surface Preparation |
Sodium Ascorbate | Fisher Scientific | 18-606-310 | Oligonucleotide Preparation |
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | Oligonucleotide Preparation |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | Surface Preparation |
Streptavidin | Fisher Scientific | 434301 | Surface Preparation |
Sulfo-NHS-LC-Biotin | Fisher Scientific | 21335 | Surface Preparation |
Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300-500 | Surface Preparation |
TEAA | Fisher Scientific | NC0322726 | Oligonucleotide Preparation |
Triethylamine | Millipore Sigma | 471283 | Oligonucleotide Preparation |
Trifluoroacetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28901 | Oligonucleotide Preparation |
THPTA | Fisher Scientific | NC1296293 | Oligonucleotide Preparation |
Triton X 100 Detergent Surfact Ams Solution | Fisher Scientific | 85111 | Immunocytochemistry |
Water, DNA Grade, DNASE, Protease free | Fisher Scientific | BP24701 | Oligonucleotide Preparation |
Equipment | |||
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm | Agilent | 653950-702 | Oligonucleotide Preparation |
High-performance liquid chromatography | Agilent | 1100 | Oligonucleotide Preparation |
Low Speed Orbital Shaker | Fisher Scientific | 10-320-813 | Immunocytochemistry |
Matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS) | Voyager STR | Oligonucleotide Preparation | |
Molecular Probes Attofluor Cell Chamber | Fisher Scientific | A7816 | Surface Preparation |
Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher | Oligonucleotide Preparation | |
Nikon Eclipse Ti inverted microscope | pe Nikon | Microscopy | |
Nikon Perfect Focus System | Nikon | Microscopy | |
NIS Elements software | Nikon | Microscopy | |
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | Microscopy | |
Quad band TIRF 405/488/561/647 cube | CHROMA | Microscopy | |
RICM Cube | CHROMA | Microscopy | |
SOLA v-nIR Light Engine | Lumencor | Microscopy | |
Thermo Forma Steri Cycle 370 CO2 Incubator | Fisher Scientific | Cell Culture | |
VWR 75D Ultrasonic Cleaner | VWR | 13710 | Surface Preparation |
Data Analysis | Use | ||
Fiji (Image J) | https://imagej.net/software/fiji/downloads | Quantitative Analysis | |
Graph Pad Prism | Graph Pad | Statistical Analysis | |
Oligo name | 5'modification/ 3' modification | Sequence (5' to 3') | Use |
Alkyne-21-BHQ2 | 5' Hexynyl/ 3' BHQ_2 | GTGAAATACCGCACAGATGCG | Top strand TGT probe |
56 pN TGT | 5' Biosg/TTTTTT/iUniAmM | CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT | Bottom strand TGT probe |
12 pN TGT | 5' AmMC6/ 3' BioTEG | CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT | Bottom strand TGT probe |