TGT-ytan är en innovativ plattform för att studera tillväxtfaktor-integrin-överhörning. Den flexibla sonddesignen, vidhäftningsligandens specificitet och exakt modulering av stimuleringsförhållanden möjliggör robusta kvantitativa bedömningar av EGFR-integrin-samspel. Resultaten lyfter fram EGFR som en “mekano-organisatör” som ställer in integrinmekanik, vilket påverkar fokal vidhäftningsenhet och cellspridning.
Flercelliga organismer förlitar sig på interaktioner mellan membranreceptorer och kognatligander i den omgivande extracellulära matrisen (ECM) för att orkestrera flera funktioner, inklusive vidhäftning, proliferation, migration och differentiering. Mekaniska krafter kan överföras från cellen via vidhäftningsreceptorn integrin till ligander i ECM. Mängden och den rumsliga organisationen av dessa cellgenererade krafter kan moduleras av tillväxtfaktorreceptorer, inklusive epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR). De verktyg som för närvarande finns tillgängliga för att kvantifiera överhörningsmedierade förändringar i cellmekanik och relatera dem till fokala vidhäftningar, cellulär morfologi och signalering är begränsade. DNA-baserade molekylära kraftsensorer som kallas spänningsmätare (TGT) har använts för att kvantifiera dessa förändringar. TGT-sonder är unika i sin förmåga att både modulera den underliggande krafttröskeln och rapportera receptorkrafter i piconewtonskala över hela den vidhäftande cellytan med diffraktionsbegränsad rumslig upplösning. TGT-sonderna som används här förlitar sig på den irreversibla dissociationen av en DNA-duplex av receptor-ligandkrafter som genererar en fluorescerande signal. Detta möjliggör kvantifiering av cellens kumulativa integrinspänning (krafthistoria). Den här artikeln beskriver ett protokoll som använder TGT för att studera effekten av EGFR på integrinmekanik och vidhäftningsbildning. Monteringen av den mekaniska avkänningsplattformen TGT är systematiskt detaljerad och proceduren för bildkrafter, fokal vidhäftningar och cellspridning beskrivs. Sammantaget gör förmågan att modulera sondens underliggande krafttröskel, vidhäftningsliganden och typen och koncentrationen av tillväxtfaktorn som används för stimulering detta till en robust plattform för att studera samspelet mellan olika membranreceptorer vid reglering av integrinmedierade krafter.
Celler har den inneboende förmågan att känna av, generera och reagera på mekaniska krafter, vilket leder till förändringar i cellulär fenotyp och ombyggnad av den lokala mikromiljön 1,2. Krafter spelar en avgörande roll för att reglera många aspekter av cellbeteende, inklusive vidhäftning, migration, spridning, differentiering och sårläkning 3,4. Avvikelser i det dubbelriktade mekaniska utbytet mellan en cell och mikromiljön kan leda till sjuka tillstånd, inklusive cancer5. Många membranreceptorer är involverade i att upprätthålla cellmatrishomeostas; av dessa har integriner och epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) robust synergi 6,7. Klassiskt etablerar integriner den mekaniska länken mellan mikromiljön och intracellulär cytoskelett medan EGFR reglerar celltillväxt, proliferation och överlevnad 8,9. EGFR är ett mycket studerat terapeutiskt mål, fokuserat på reglering utifrån och in som underlättar intracellulär signalering. EGFR-integrin crosstalk har etablerats genetiskt och biokemiskt för att reglera utvecklingen av flera sjukdomar, inklusive cancer10,11. Medan studier indikerar förekomsten av EGFR-integrin-samspel, tillskrivs resultaten signalvägar bort från plasmamembranet 7,12,13,14. Effekten av EGFR, eller andra tillväxtfaktorer, på cellmekaniken förblir i stort sett outforskad delvis på grund av bristen på verktyg för att mäta cellulära krafter och signaleringsresultat. Utmaningen ligger i att identifiera lämpliga verktyg för att studera kommunikationen mellan dessa parallella signalparadigmer och för att kvantifiera deras specifika bidrag till cellmekaniken.
Flera metoder har utvecklats för att mäta krafter som genereras av celladhesionsreceptorer, och läsaren hänvisas till djupgående granskningar av dessa tekniker15,16. Kortfattat förlitar sig dragkraftsmikroskopi och mikropelarmatrisdetektering på deformationen av ett underliggande substrat för att härleda nanonewton (nN) -krafter, en storleksordning mer än enskilda receptorkrafter17,18. Enmolekyltekniker, inklusive AFM och optisk pincett, är känsliga för enstaka protein piconewton (pN) krafter men mäter bara en receptor i taget och erbjuder inte bra (eller någon) rumslig upplösning. DNA-baserade molekylära spänningssonder och TGT-sonder (spänningsmätare) erbjuder pN-kraftupplösning med diffraktionsbegränsad (eller bättre) rumslig upplösning, vilket ger dem en unik roll i att studera encellskrafter19,20 från olika celltyper, inklusive fibroblaster, cancerceller, blodplättar och immunceller 21,22,23,24 . Medan molekylära spänningssonder har ett utdragbart “fjäder” -element, idealiskt för realtidsavbildning, brister TGT-sonder irreversibelt och lämnar efter sig en fluorescerande “krafthistoria”. TGT modulerar dessutom spänningströskeln för det underliggande substratet; en serie sonder med liknande kemiska sammansättningar men olika brottkrafter, eller spänningstoleranser (Ttol), kan användas för att kvantifiera den minsta spänning som krävs för fokal vidhäftningsbildning och cellspridning. TGT-sonder består av två komplementära DNA-strängar, en förankrad på ytan och den andra presenterar en ligand till cellen. Om en receptor binder liganden och utövar en kraft som är större än sondensT-tol, kommer strängarna att separeras. Ttol definieras som den konstanta kraft som behövs för att bryta 50% av sonderna i ett 2 s intervall under ideala förhållanden. I “påslagna” TGT-sonder kan en släckare på den övre strängen separeras från en fluorofor på bottensträngen. Endast där TGT-sonden har spruckit, förmodligen av krafter som är större än eller lika med Ttol, kommer en fluorescerande signal att genereras. TGT-sonder kan också fixas, vilket möjliggör enkel manipulation av biologiska system och testning av flera förhållanden. Av dessa skäl användes TGT-sonder i detta arbete.
TGT-sonder användes för att studera hur integrinberoende celladhesion och mekaniska krafter moduleras av aktiverad EGFR21. Detta arbete etablerade EGFR som en “mekano-organisatör”, som ställde in fokal vidhäftningsorganisation och spänningsgenerering. Dessutom visade det sig att EGF-stimulering påverkade fördelningen och mognaden av fokala vidhäftningar och förbättrad cellspridning. Detta tillvägagångssätt kan användas i framtida studier för att undersöka hur tillväxtfaktorer påverkar mekaniska krafter i tumörprogression och dynamik. Medan rollen som EGFR-integrin-överhörning för att reglera epitelial till mesenkymal övergång är etablerad, är mekaniska krafters roll i denna process fortfarande underutforskad10.
Här presenteras ett detaljerat protokoll för dessa experiment som täcker syntes och montering av 56 pN TGT-sonder, generering av TGT-ytor på glasöverdrag, applicering av Cos-7-celler på TGT-ytan och stimulering med EGF, fixering och färgning av celler med falloidin och en anti-paxillin-antikropp, högupplöst total intern reflektionsfluorescens (TIRF) och reflektionsinterferenskontrastmikroskopi (RICM) -avbildning, och bildkvantifiering. Detta protokoll, även om det är skrivet för att undersöka EGF-stimulering av Cos-7-celler, är lätt anpassningsbart för många TGT-baserade experiment. Olika ligander,T-tol, celltyper, stimuleringsparametrar, proteiner märkta efter fixering och kvantitativ analys kan enkelt ersättas, vilket gör detta protokoll robust och allmänt användbart.
Med den detaljerade steg-för-steg-proceduren som beskrivs ovan kan man förbereda TGT-ytor för att kvantifiera cellmorfologi och integrinspänning som genereras av vidhäftande celler under cellfästning och spridning efter behandling med EGF. Den enkla sonddesignen och syntesen och ytbehandlingen tillsammans med den enkla experimentella installationen gav en stabil plattform för att studera interaktionen mellan EGFR och integriner. Sammantaget validerar resultaten att ligandberoende aktivering av EGFR förbättrar cellspridning, ställer in de kraftbärande egenskaperna hos integrinreceptorer och främjar fokal vidhäftningsorganisation och mognad. Resultaten som erhållits med hjälp av TGT-sonder stöder den övergripande hypotesen att tillväxtfaktorer, såsom EGFR, fungerar som “mekano-arrangörer”, vilket ökar mängden och den rumsliga organisationen av integrinspänning och reglerar orienteringen och mekaniken för fokal vidhäftningar.
Vid applicering på TGT-ytan landar cellerna, fäster och sprider sig när integrinreceptorerna (αVβ3) känner av och binder till cRGDfK-liganden. På så sätt kan TGT-sonderna brytas mekaniskt, vilket genererar fluorescens vid platsen för ligandengagemang. Avläsningen är den kumulativa “krafthistoriken” för cellen som interagerar med ytan. Det finns några vanliga problem med TGT-ytorna som kan förekomma under dessa experiment. Hög ytbakgrundsfluorescens (figur 6A,B), ojämnt ytutseende, cellernas misslyckande med att generera spänningssignal (figur 6C,D) och att celler inte sprider sig (figur 6E,F) kan bero på tekniska brister med TGT-sonden eller ytsyntesen. Lösningar på dessa vanliga problem presenteras i tabell 1.
Den enkla utformningen av TGT-sonder ger cellbiologer ett kraftfullt verktyg för att studera specifika tillväxtfaktor-integrinsignaleringsresultat isolerat utan störningar från andra cellytereceptorer genom att endast tillhandahålla specifika ligander och stimuleringar. Dessutom möjliggör TGT-sonder undersökning av spänningströskeln som understryker enskilda integrinreceptorer under celladhesion vid pN-känslighet. Alternativa metoder misslyckas med att rapportera krafter som utövas av enskilda receptorer med hög rumslig upplösning i fasta prover31. Dragkraftsmikroskopi är endast känslig för nN-krafter, en storleksordning högre än de krafter som appliceras av enskilda integrinreceptorer15, och molekylära spänningssonder mäter pN-krafter, men eftersom de är reversibla tål de inte robust fixering. Av dessa skäl är TGT-sonder ett attraktivt verktyg för att studera mekaniken för tillväxtfaktor-integrininteraktioner.
Det finns flera tekniska nyanser associerade med TGT-sonder som bör beaktas innan du utformar ett experiment. Spänningsbilden är en ögonblicksbild i tid, som representerar krafthistoriken och inte en indikator på receptor-ligand-engagemangen vid en given tidpunkt. Eftersom signalgenerering är beroende av sondelseparation är TGT-fluorescensen resultatet av öppna sonder som inte är under aktiv spänning från receptor-ligand-engagemang. Detta innebär att avläsningen för integrinspänning som erhållits på TGT-ytan är historisk och kumulativ till sin natur som representerar var det fanns krafter större än Ttol; platserna för nuvarande receptor-ligandkrafter mindre än Ttol rapporteras inte19,32. Eftersom TGT-bristning resulterar i uppsägning av receptor-ligand-engagemanget beror cellspridning på integrin-ligandinteraktioner som upplever krafter lägre änT-tol. Användaren måste därför vara försiktig när han definierar tiden efter plätering för att uppskatta de mekaniska resultaten i samband med integrinbaserade vidhäftningar. Slutligen måste betydelsen av Ttol övervägas. TGT-sonderna som används här har enT-tol på 56 pN, därT-tol är den konstanta kraften som behövs för att bryta 50% av sonderna när de appliceras på 2 s. När man överväger komplicerade biologiska system upplever TGT: er sannolikt en heterogen och mångsidig kraftgradering med varierande tidsberoenden. Om TGT: er bryts av krafter större än Ttol, skulle fluorescensen vara en underskattning av den totala spänningen. Alternativt kan krafter under Ttol som appliceras under längre varaktigheter bryta ett liknande antal sonder som höga tröskelkrafter som appliceras under kortare tider. Båda dessa scenarier kan resultera i samma fluorescensintensitetsavläsning, vilket gör det svårt att lösa den exakta spänningsstorleken eller dynamiken med hjälp av TGT-sonder33,34.
Sammantaget bör bedömningar av integrinspänning med tillväxtfaktorstimulering göras noggrant genom att utforma experiment med interna kontroller, jämföra spridningsprofiler på andra matrisbelagda ytor, göra parallella bedömningar av TGT-fluorescens i celler i närvaro eller frånvaro av tillväxtfaktorstimulering och använda TGT med olikaT-tol . TGTs möjliggör kvantifiering av rollen som tillväxtfaktorsignalering för att reglera mekaniken hos integrinreceptorer, fokal vidhäftningsdynamik och cellspridning. Detta protokoll kan användas som mall för många TGT-baserade experiment med hjälp av sonder med olikaT-tol, olika ligander, olika celltyper eller olika stimuleringsförhållanden. Alla proteiner av intresse kan märkas efter fixering, och vilken typ av kvantitativ bildanalys som helst kan implementeras. Som sådan presenterar vi en mall för många TGT-experiment.
Användningen av TGT-sonder är inte begränsad till att studera integriner utan kan utvidgas till en mängd olika cellmembranreceptorer över olika celltyper genom att modifiera liganden. TGT-sonder har använts för att undersöka krafternas roll vid reglering av olika receptorsignalkaskader, inklusive identifiering av den mekaniska rollen hos Notch-receptormekanik i embryonal utveckling och neurogenes35, krafterna som förmedlar identifiering och internalisering av antigener av B-cellreceptorer36 och den mekaniska korrekturläsningsförmågan hos T-cellsytereceptorer för att upptäcka förändringar i krafter för att öka styrkan och specificiteten hos signalöverföring37 . Tillsammans belyser dessa resultat den enorma potentialen hos TGT-sonder i en mängd olika experimentella miljöer.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill uppmärksamma medlemmarna i Mattheyses-laboratoriet för fruktbara diskussioner och kritik. Vi erkänner finansiering till A.L.M. från NSF CAREER 1832100 och NIH R01GM131099.
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Millipore Sigma | 440140 | Surface Preparation |
3-hydroxypicolinic acid (3-HPA) | Millipore Sigma | 56197 | Maldi-TOF-MS matrix |
Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | A38S | Diluting EGF |
Acetonitrile (HPLC) | Fisher Scientific | A998SK | Oligonucleotide Preparation |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Cell Signaling Technology | 8878S | Immunocytochemistry |
Ammonium Chloride | Fisher Scientific | A687 | Immunocytochemistry |
Anti-Paxillin antibody [Y113] | Abcam | ab32084 | Immunocytochemistry |
BD Syringes only with Luer-Lok | BD bioscience | 309657 | Surface Preparation |
Bio-Gel P-2 | Bio-Rad | 1504118 | Oligonucleotide Preparation |
Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | Surface Preparation |
Cos-7 cells | ATCC | CRL-1651 | Cell Culture, Passage numbers 11-20 |
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips | Fisher Scientific | C14784 | Surface Preparation |
c(RGDfK(PEG-PEG)), PEG=8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid | Vivitide | PCI-3696-PI | Oligonucleotide Preparation |
Cy3B NHS ester | GE Healthcare | PA63101 | Oligonucleotide Preparation |
Dimethylformamide | Millipore Sigma | PHR1553 | Oligonucleotide Preparation |
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013C | Cell Culture |
Epidermal Growth Factor human EGF | Millipore Sigma | E9644 | Cell Culture |
Ethanol, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22032601 | Surface Preparation |
Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08-772E | Surface Preparation |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10-438-026 | Cell Culture |
Flurobrite DMEM | Fisher Scientific | A1896701 | Cell Culture |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21244 | Immunocytochemistry |
Goat Serum | Fisher Scientific | 16-210-064 | Immunocytochemistry |
Hank’s balanced salts (HBSS) | Fisher Scientific | 14-170-161 | Cell Culture |
Horse Serum | Fisher Scientific | 16050130 | Immunocytochemistry |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-500 | Surface Preparation |
Nanosep MF centrifugal devices | Pall laboratory | ODM02C35 | Oligonucleotide Preparation |
NHS-azide | Fisher Scientific | 88902 | Oligonucleotide Preparation |
Nitrogen Gas Cylinder | Airgas | Surface Preparation | |
No. 2 round glass coverslips – 25 mm | VWR | 48382-085 | Surface Preparation |
Parafilm M Laboratory Film | Fisher Scientific | 13-374-10 | Surface Preparation |
Paraformaldehyde 16% | Fisher Scientific | 50-980-487 | Immunocytochemistry |
PBS, 1X | Fisher Scientific | 21-030-CV | Surface Preparation/Immunocytochemistry |
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15-070-063 | Cell Culture |
PYREX Low Form Griffin Beakers | Fisher Scientific | 02-540G | Surface Preparation |
Sodium Ascorbate | Fisher Scientific | 18-606-310 | Oligonucleotide Preparation |
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | Oligonucleotide Preparation |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | Surface Preparation |
Streptavidin | Fisher Scientific | 434301 | Surface Preparation |
Sulfo-NHS-LC-Biotin | Fisher Scientific | 21335 | Surface Preparation |
Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300-500 | Surface Preparation |
TEAA | Fisher Scientific | NC0322726 | Oligonucleotide Preparation |
Triethylamine | Millipore Sigma | 471283 | Oligonucleotide Preparation |
Trifluoroacetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28901 | Oligonucleotide Preparation |
THPTA | Fisher Scientific | NC1296293 | Oligonucleotide Preparation |
Triton X 100 Detergent Surfact Ams Solution | Fisher Scientific | 85111 | Immunocytochemistry |
Water, DNA Grade, DNASE, Protease free | Fisher Scientific | BP24701 | Oligonucleotide Preparation |
Equipment | |||
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm | Agilent | 653950-702 | Oligonucleotide Preparation |
High-performance liquid chromatography | Agilent | 1100 | Oligonucleotide Preparation |
Low Speed Orbital Shaker | Fisher Scientific | 10-320-813 | Immunocytochemistry |
Matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS) | Voyager STR | Oligonucleotide Preparation | |
Molecular Probes Attofluor Cell Chamber | Fisher Scientific | A7816 | Surface Preparation |
Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher | Oligonucleotide Preparation | |
Nikon Eclipse Ti inverted microscope | pe Nikon | Microscopy | |
Nikon Perfect Focus System | Nikon | Microscopy | |
NIS Elements software | Nikon | Microscopy | |
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | Microscopy | |
Quad band TIRF 405/488/561/647 cube | CHROMA | Microscopy | |
RICM Cube | CHROMA | Microscopy | |
SOLA v-nIR Light Engine | Lumencor | Microscopy | |
Thermo Forma Steri Cycle 370 CO2 Incubator | Fisher Scientific | Cell Culture | |
VWR 75D Ultrasonic Cleaner | VWR | 13710 | Surface Preparation |
Data Analysis | Use | ||
Fiji (Image J) | https://imagej.net/software/fiji/downloads | Quantitative Analysis | |
Graph Pad Prism | Graph Pad | Statistical Analysis | |
Oligo name | 5'modification/ 3' modification | Sequence (5' to 3') | Use |
Alkyne-21-BHQ2 | 5' Hexynyl/ 3' BHQ_2 | GTGAAATACCGCACAGATGCG | Top strand TGT probe |
56 pN TGT | 5' Biosg/TTTTTT/iUniAmM | CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT | Bottom strand TGT probe |
12 pN TGT | 5' AmMC6/ 3' BioTEG | CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT | Bottom strand TGT probe |