Entwicklung antiviraler Wirkstoffe mittels Oberflächenplasmonenresonanz
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt neue Werkzeuge für SPR-Bindungsassays zur Untersuchung der CV-N-Bindung an HA, S-Glykoprotein, verwandte Hybrid-Glykane und High-Mannose-Oligosaccharide. SPR wird verwendet, um das KD für die Bindung von entweder dimerem oder monomerem CV-N an diese Glykane zu bestimmen.
Abstract
Die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) wird verwendet, um die Bindung von Hämagglutinin (HA) an das domänenvertauschte Cyanovirin-N (CV-N)-Dimer zu messen und die Wechselwirkungen zwischen mannosylierten Peptiden und der hochaffinen Bindungsstelle von CV-N zu überwachen. Es wurde berichtet, dass die Virushüllenspitzen gp120, HA und Ebola-Glykoprotein (GP) 1,2 sowohl hoch- als auch niedrigaffine Bindungsstellen an dimeres CVN2 binden. Dimannosyliertes HA-Peptid ist auch an den beiden niedrigaffinen Bindungsstellen an ein konstruiertes Molekül von CVN2 gebunden, das eine hochaffine Stelle für den jeweiligen Liganden trägt und mutiert, um eine stabilisierende Disulfidbindung in der kohlenhydratbindenden Tasche zu ersetzen, wodurch eine multivalente Bindung bestätigt wird. Es wird eine HA-Bindung an eine hochaffine Bindungsstelle des Pseudo-Antikörpers CVN2 bei einer Dissoziationskonstante (KD) von 275 nM gezeigt, die das humane Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) durch Oligomerisierung weiter neutralisiert. Die Korrelation der Anzahl der Disulfidbrücken in domänenvertauschtem CVN2, die durch Substitution von Cystinen in polare Restpaare aus Glutaminsäure und Arginin von 4 auf 2 verringert werden, führt zu einer reduzierten Bindungsaffinität zu HA. Unter den stärksten Wechselwirkungen wird Ebola GP1,2 von CVN2 mit zwei hochaffinen Bindungsstellen im unteren nanomolaren Bereich unter Verwendung des Hüllglykans ohne Transmembrandomäne gebunden. In der vorliegenden Studie wird die Bindung des multispezifischen monomeren CV-N an das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Spike (S) Glykoprotein bei K D = 18,6 μM im Vergleich zu nanomolaren KD an diese anderen Virusspitzen und über seine rezeptorbindende Domäne im mittleren μ-molaren Bereich gemessen.
Introduction
Tetherin-assoziierte antivirale Aktivität wird durch Interferon-α induziert und umfasst proteinbasierte Tether, die zur Retention von vollständig ausgebildeten Virionen auf infizierten Zelloberflächen führen1. Die Notwendigkeit einer Tetheringlykosylierung bei der Hemmung der Virusfreisetzung bleibt ungewiss, was die Bedeutung von Glykosylierungsmustern auf rekombinant exprimierten Glykanen für In-vitro-Studien 1,2 impliziert, die von der Konformation von (im Falle des Influenzavirus) oberflächenexprimiertem Influenzahämagglutinin HA 3,4 abhängt. . Es wurde festgestellt, dass die Modifikation von Oligosaccharid, das an die N-verknüpfte Glykosylierung gebunden ist, für eine Tetherin-vermittelte Restriktion der HIV-Typ-1-Freisetzung2 ausreicht, während die Dimerisierung eine wesentliche Rolle bei der Verhinderung der Virusfreisetzung spielt, wodurch die Transmembrandomäne oder der Glykosyl-Phosphatidyl-Inositol (GPI)-Anker zum Anbinden der knospenden Virionen beteiligt ist5 . Es werden einzigartige Funktionen für menschliches und murines Tetherin beschrieben, um mehrere behüllte Viren, Retroviren und Filoviren zu blockieren. BST-2/Tetherin ist ein Interferon-induzierbares antivirales Protein der angeborenen Immunität1,6, das mit antiviraler Breitbandaktivität wirkt und durch Hüllglykoproteine5 antagonisiert wird, um entweder Tetherin zu translozieren oder die Struktur von Tetherin 6 zu stören. Zum Beispiel sind oberflächenexprimierte Hüllglykoprotein HA und Neuraminidase auf Influenza-A-Virus für Tetherin-Antagonismus in einer stammspezifischen Weise bekannt7, was die Erkennung von Wirtsrezeptorbindungsstellen erleichtert8. Glykan-Targeting-Antikörper werden in der Stöchiometrie ihrer Wechselwirkungen mit den schnell anpassenden Glykanschilden auf HA untersucht, was zu einer Bindungsaffinität zu Influenza A H3N2 und H1N1 Subtypen4 führt.
Um die Bindungsmechanismen zwischen antiviralen Wirkstoffen und Virushüllenspitzen, d.h. Kohlenhydratliganden, und komplementären immunologischen und spektroskopischen Methoden aufzuklären, werden Mono-, Di- und Tri-Mannose-Einheiten chemisch synthetisiert. Die mannosylierten Peptide werden durch Azido-Glykosylierung von Glykosyl {beta}-Peracetaten zu 1,2-trans-Glykosylaziden-Transformation9 erzeugt, die das typischerweise vorkommende N-Acetylglucosamin und die Oligosaccharide mit hohem Mannosegehalt auf der Oberfläche lebensbedrohlicher Viren nachahmen. Triazol-Bioisoster werden verwendet, um Verknüpfungen nachzuahmen, die den mannosylierten Rest des HA-Peptids10 bilden, und erleichtern ortsspezifische Wechselwirkungen mit antiviralen CV-N-Derivaten um den zweiten N-verknüpften Glykosylierungspunkt auf der HA-Kopfdomäne (HA-Spitze mit 4 N-verknüpften Glykanen N54, N97, N181, N301)8,11,12 . Wechselwirkungen zwischen Glutaminsäure (Glu) und Arginin (Arg) und der resultierende Helix-Dipol zeigten eine gute Stabilität sowohl von Modellpeptiden als auch von Proteinen, werden aber mit SPR visualisiert. Im Vergleich zur Erkennung einer einzelnen chemisch synthetisierten Glykosylierungsstelle auf HA10 durch direkte Hemmung der Rezeptorbindung an die Glykaneinheiten wird gezeigt, dass eine höhere Affinität einer vierfach mutierten Fc-Struktur zu ihrem Rezeptor Effektorfunktionen in vivo hervorruft, was zeigt, dass die nicht verwandte Zusammensetzung von N-verknüpften Glykanen, die an die Fc-Mutante gebunden sind, mechanistisch bestimmt werdensoll 13.
CV-N zeigt antivirale Aktivität gegen HIV 14,15, Influenza 16 und das Ebola-Virus, die durch nanomolare Bindung an hochmannose Oligosaccharidmodifikationen auf Hüllspitzenproteinenvermittelt wird 12,17,18,19. Die Bindung von Influenza HA an eine hochaffine Kohlenhydratbindungsstelle (H) in CV-N oder an zwei Hs in kovalent verknüpftem dimerem CVN2 hat Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (K D) = 5,7 nM (Abbildung 1A) bzw. KD = 2,7 nM. Sowohl CV-N als auch CVN2 beherbergen weitere ein oder zwei kohlenhydratbindende Stellen mit niedriger Affinität (L)s 12,17,20,21. Ebola GP1,2 bindet an 2H CVN2 mit Affinitäten im unteren nanomolaren Bereich (KD = 26 nM). CV-N WT-Bindung an Ebola GP1,2 und HA weist Affinitäten von K D = 34 nM bis KD = 5,7 nM auf (A/New York/55/04)12. Lektine wie CV-N, die spezifisch auf hochmannose Glykane auf den Virushüllen abzielen, hemmen die Replikation von Hepatitis-C-Virus, SARS-CoV, Herpesvirus, Marburg-Virus und Masernvirus22.
Das kleine CV-N-Molekül wird seit mehr als 20 Jahren gründlich untersucht, da es funktionalisiert, um eine Vielzahl von Viren zu binden, um den viralen Eintritt zu hemmen16,18. Strukturanalysen und Bindungsaffinitätstests deuten auf eine Vernetzung von zwei Ls in einem domänenvertauschten CVN2-Dimer durch bivalente Bindung im mikromolaren Bereich hin, um die Avidität zu viralen Hüllglykoproteinen zu erhöhen10,19. Die selektive Bindung von Manα1-2Manα an Man(8)-D1D3-Armen und Man(9) umfasst zwei Bindungsstellen unterschiedlicher Affinitäten, die sich auf gegenüberliegenden Proteinprotomern20 befinden und dadurch nanomolare Bindungsaffinitäten erreichen (Abbildung 1B). Daher gilt CVN2 als Pseudo-Antikörper hinsichtlich seiner Anwendung zur Bindung von Epitopen an HIV gp120, ähnlich wie virusneutralisierende Antikörper17. Hier ist der Autor daran interessiert, die mögliche Bindung von CVN2 an den SARS-CoV-2-Spike über seine Rezeptorbindungsdomäne (RBD) zu untersuchen. Bindungskurven des immobilisierten humanen Angiotensin-Converting-Enzyms (ACE)-2 mit dem SARS-CoV-2 RBD ergeben KD = 4,7 nM für diese biologisch relevante Bindungsinteraktion23.
Im Gegensatz dazu erkennen ausgewählte Immunglobulinklassen spezifische und konsistente strukturelle Proteinmuster, die ein Substrat für die Affinitätsreifung in den membranverankerten HA-Regionen vermitteln24. CV-N zeigt eine hochwirksame Aktivität in fast allen Influenza-A- und B-Viren16 und ist ein weitgehend neutralisierendes antivirales Mittel. Unser Wissen ist unvollständig über die Lage von Zielepitopen am Stamm von HA1 und HA2, die möglicherweise epitopische Strukturen für das Glykan-Targeting durch stark neutralisierende Antikörper und im Vergleich zur Lektinbindungbeinhalten 25.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des SPR-Bindungsassays für CV-N-zu-Virus-Hüllkurvenspitzen. (A) SPR-Assay für CV-N-Bindung an Liganden: HA-Protein voller Länge (90 kDa). Kinetischer Datensatz (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 0 nM) mit doppelter Bindung an Influenza HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0-Variante V2 bindet an immobilisierten Liganden DM in einem Konzentrationsbereich von 500 nM bis 16 μM. Sequenz: L-Reste sind gelb markiert. H-Rückstände werden grau hervorgehoben. E58 und R73 sind ein Ersatz für Cystein im Wildtyp-Protein und machen V2 zu einer stabilen Proteinfaltung mit drei statt vier Disulfidbindungen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Während die Glykanabschirmung auf dem membrandistalen HA-Oberteil eine hochaffine Bindung anCV-N12 induziert, wurde eine CVN2-Bindung an HA neben einer Disulfidbrücke des HA-Oberteils weiter an seinen niederaffinen Stellen10,12 beobachtet. Verschiedene polare Wechselwirkungen und Interaktionsstellen werden in der Kohlenhydratbindung durch CV-N identifiziert. Diese Wechselwirkungen werden verifiziert, indem Knock-out-Varianten in der Bindungsstelle erzeugt werden, um Bindungsaffinitäten mit in silico vorhergesagter Glykosylierung zu korrelieren12. Daher zielt das Projekt darauf ab, zuvor getestete chemisch mannosylierte HA-Peptide in Bindungsaffinität und Spezifität mit kurzen Peptidsequenzen aus SARS-bezogenen 2019-nCoV-Spikes und SARS-CoV-2 zu vergleichen, die natürlich durch eine kleine Anzahl verschiedener N-verknüpfter Glykosylierungsstellen und O-verknüpfter Glykosylierung modifiziert vorkommen. Unter Verwendung von Kryo-Elektronenmikroskopie und Bindungsassays berichten Pinto und Mitarbeiter über einen monoklonalen Antikörper, S309, der möglicherweise ein Epitop auf SARS-CoV-2-Spike-Protein erkennt, das ein konserviertes Glykan innerhalb der Sarbecovirus-Untergattung enthält, ohne mit der Rezeptorbindungzu konkurrieren 26. Das Protokoll dieser Studie beschreibt, wie wichtig das Design, die Expression und die Charakterisierung von CV-N-Varianten sind, um zu untersuchen, wie CV-N und CVN2 an glykosylierte Proteine und synthetische mannosylierte Peptide unter Verwendung der SPR-Technologie10,12 binden.
Tandem-gebundenes Dimer CVN2L027 und Bindungsstellenvarianten (V2-V5) werden rekombinant exprimiert, Varianten mit Disulfidbindungsersatz (C58E und C73R) (Abbildung 2A). Auch eine Mutante mit einer Einzelpunktmutation E41A wird hergestellt, da diese Position als intermolekularer Kreuzkontaktrest angesehen wurde. Diese Mutante ist ein weiteres interessantes Molekül für SPR-Bindungsmessungen zwischen den Lektin- und High-Mannose-Oligosacchariden, die Bindungsdomänen entschlüsseln und den Vergleich mit der dimeren Form ermöglichen. Die domänenvertauschte Kristallstruktur von CVN2 zeigt einen flexiblen Linker, der sich zwischen 49 und 54 Resten erstreckt. Die beiden Domänen können sich weiterhin als starre Körper um das Scharnier bewegen und entweder ein Monomer durch intramolekulare Domänenwechselwirkungen entwickeln (Domäne A -Reste 1-39;90-101- mit Domäne B -Reste 40-89) oder ein Dimer durch intermolekularen Domänentausch [Domäne A (des ersten Monomers) mit Domäne B (des zweiten) und Domäne B (des ersten Monomers) mit Domäne A (der zweiten Kopie)]. Es gibt keine engen Wechselwirkungen zwischen den A- und B-Domänen der beiden Protomer, mit Ausnahme von Glu4128. Das Gen für CV-N kann unter Verwendung einer repetitiven PCR-Methode mit 40-mer-synthetisierten Oligos29 entwickelt und dann in die NdeI- und BamHI-Stellen von pET11a subkloniert werden, um sie in elektrokompetente Zellen umzuwandeln (Elektroporation), wie von Keeffe, J.R.27 beschrieben. Das Protein, das zur Erreichung der jeweiligen Kristallstruktur (PDB ID 3S3Y) verwendet wird, enthält eine N-terminale 6-Histidin-Reinigungsmarke, gefolgt von einer Faktor-Xa-Protease-Spaltstelle. Die ortsgesteuerte Mutagenese wird verwendet, um Punktmutationen vorzunehmen, Codons zu wechseln und einzelne oder mehrere Basen oder Codons für den Aminosäureaustausch einzufügen oder zu löschen. Diese Umwandlungen liefern unschätzbare Einblicke in die Funktion und Struktur von Proteinen. Rekombinant exprimierte und gereinigte CV-N, CVN2 und CVN3 wurden biophysikalisch gut untersucht20,21,27, sind billig herzustellen und werden daher zur Charakterisierung von Bindungsassays an Glykane verwendet, die auf SPR-Sensorchips immobilisiert sind. Der konventionelle Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) bietet eine geringere Reproduzierbarkeit in Bezug auf die Immobilisierungstechnik von Glykanliganden und wandelt die Echtzeitbindung verschiedener Bindungsstellenvarianten, die für SPR gezeigt wird, in Endpunktassays um.
Die Bindungsaffinitätsvariante CVN2L0-V2 (eine intakte Falte homodimeren CV-N mit einer Disulfidbrückensubstitution10) wird mit einem His-Tag in Escherichia coli (E. coli) exprimiert, über die Ni-NTA-Säule unter Anwendung der Affinitätschromatographie gereinigt und auf Bindung an HA (H3N2), monomannosyliertes HA-Peptid und dimannosyliertes HA-Peptid unter Verwendung von SPR getestet. Chemisch mannosylierte Peptide oder HA- und S-Proteine sind alle Liganden und Amin, die an die hydrophile Chipoberfläche gekoppelt sind über reaktive Ester oder Biotin-Streptavidin-Protein-Engineering. Das gleiche Verfahren der sequentiellen Durchläufe wird auf diese Liganden angewendet, wobei verschiedene Verdünnungen von CV-N und Varianten von CV-N (und CVN2) injiziert werden, um kinetische Informationen für die molekularen Interaktionsanalysen zu erhalten, wie untenbeschrieben 30. RBD-immobilisierter SPR-Sensorchip wird für Bindungsstudien an CV-N- zu S-Peptiden verwendet, und Affinitäten werden mit der SARS-CoV-2-Bindung mit dem menschlichen ACE2 verglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Bindungsaffinität von CV-N korreliert mit der Anzahl der funktionalen Bindungsstellen [2H auf Domänen B und 2L auf Domänen A, wenn sie als domänenvertauschtes Dimer entwickelt wurden]. Eine Variante mit veränderter Bindungsaffinität (CVN2L0-V2, eine homodimere stabile Falte von CV-N, die einen Disulfidbrücken-Knock-out umfasst) wird in E. coli exprimiert, gereinigt und positiv auf Bindung an HA-Protein (H3N2) unter Verwendung von SPR10 getestet und zeigt eine Konformationsände…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der Autor dankt Dr. Christian Derntl vom Department für Biotechnologie und Mikrobiologie der TU Wien und der Universitätsklinik für Medizin III, Abteilung für Nephrologie und Dialyse der Medizinischen Universität Wien, insbesondere Dr. Markus Wahrmann für die technische und wissenschaftliche Unterstützung. Die Proteinexpression in Säugetierzellen wurde vom Department für Biotechnologie der Universität für Bodenkultur (BOKU) Wien unterstützt. Die Autorin dankt Dr. Nico Dankbar von XanTec bioanalytics in Düsseldorf für hilfreiche wissenschaftliche Diskussionen zur Durchführung der SPR-Bindungsassays.
Materials
| Äkta primeplus | Cytiva | ||
| Amicon tubes | Merck | C7715 | |
| Ampillicin | Sigma-Aldrich | A5354 | |
| Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B06320 | |
| Cell spreader | Sigma-Aldrich | HS86655 | silver stainless steel, bar L 33 mm |
| Custom DNA Oligos | Sigma-Aldrich | OLIGO | |
| Custom Gensynthesis | GenScript | #1390661 | cloning vector: pET27b(+) |
| Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL | Thermo Scientific | 50-105-5354 | |
| Dionex UlitMate 3000 | Thermo Scientific | IQLAAAGABHFAPBMBFB | |
| Dpn I restriction enzyme (10 U/μL) | Fisher Scientific | ER1701 | |
| DTT | Merck | DTT-RO | |
| EDC | Merck | 39391 | |
| EDTA | Merck | E9884 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge | Sigma-Aldrich | Z606235 | |
| Ethanol | Merck | 51976 | |
| Ethanolamine HCl | Merck | E6133 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack | Corning | 352057 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| Glycine HCl | Merck | 55097 | |
| HA H3 protein | Abcam | ab69751 | |
| HEPES | Merck | H3375 | |
| His-select Ni2+ | Merck | H0537 | |
| Imidazole | Merck | I2399 | |
| IPTG | Merck | I6758 | |
| Kanamycin A | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Kromasil 300-5-C4 | Nouryon | ||
| LB agar | Merck | 52062 | |
| LB agar | Merck | 19344 | |
| LB Lennox | Merck | L3022 | |
| Lysozyme | Merck | 10837059001 | |
| Magnesium chloride | Merck | M8266 | |
| Magnesium sulfate | Merck | M7506 | |
| NaH2P04 | Merck | S0751 | |
| NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| NaOH | Merck | S5881 | |
| NHS | Merck | 130672 | |
| NZ amine (casein hydrolysate) | Merck | C0626 | |
| PBS | Merck | 806552 | |
| PD MidiTrap G-10 | Sigma-Aldrich | GE28-9180-11 | |
| Peptone | Merck | 70171 | |
| pET11a | Merck Millipore (Novagen) | 69436 | |
| PMSF | Merck | PMSF-RO | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) | Qiagen | 27106X4 | |
| Reichert Software Package Autolink1-1-9 | Reichert | ||
| Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System | Reichert | ||
| Scrubber2-2012-09-04 for data analysis | Reichert | ||
| SDS | Merck | 11667289001 | |
| Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid | Stratagene | #200518 | |
| Sodim chloride | Merck | S9888 | |
| Sodium acetate.Trihydrate | Merck | 236500 | |
| SPR sensor chip C19RBDHC30M | XanTec bioanalytics | SCR C19RBDHC30M | |
| SPR sensor chip CMD500D | XanTec bioanalytics | SCR CMD500D | |
| Sterilin Standard 90mm Petri Dishes | Thermo Scientific | 101R20 | |
| TBS | Merck | T5912 | 10x, solution |
| Triton-X100 | Merck | T8787 | |
| Tryptone | Merck | 93657 | |
| Tween20 | Merck | P1379 | |
| Vortex-Genie 2 Mixer | Merck | Z258423 | |
| X-gal | Merck | XGAL-RO | |
| XL1-Blue Supercompetent Cells | Stratagene | #200236 | |
| Yeast extract | Merck | Y1625 |
Referências
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