Ingegneria di agenti antivirali tramite risonanza plasmonica di superficie

Summary

Il presente protocollo descrive nuovi strumenti per i saggi di legame SPR per esaminare il legame CV-N a HA, glicoproteina S, glicani di tipo ibrido correlati e oligosaccaridi ad alto mannosio. SPR è usato per determinare il K_D per legare CV-N dimerico o monomerico a questi glicani.

Abstract

La risonanza plasmonica di superficie (SPR) viene utilizzata per misurare il legame dell’emoagglutinina (HA) al dimero di cianovirina-N (CV-N) scambiato di dominio e per monitorare le interazioni tra peptidi mannosilati e sito di legame ad alta affinità di CV-N. I picchi dell’involucro virale gp120, HA e glicoproteina di Ebola (GP) 1,2 sono stati segnalati per legare entrambi i siti di legame ad alta e bassa affinità su CVN2 dimerico. Il peptide HA dimannosilato è anche legato nei due siti di legame a bassa affinità a una molecola ingegnerizzata di CVN2, che porta un sito ad alta affinità per il rispettivo ligando e muta per sostituire un legame disolfuro stabilizzante nella tasca di legame dei carboidrati, confermando così il legame multivalente. Il legame con l’HA è mostrato in un sito di legame ad alta affinità dello pseudo-anticorpo CVN2 a una costante di dissociazione (K_D) di 275 nM che neutralizza ulteriormente il virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) attraverso l’oligomerizzazione. Correlando il numero di ponti disolfuro in CVN2 scambiati di dominio, che sono diminuiti da 4 a 2 sostituendo le cistine in coppie di residui polari di acido glutammico e arginina, si ottiene una ridotta affinità di legame con l’HA. Tra le interazioni più forti, Ebola GP1,2 è legato da CVN2 con due siti di legame ad alta affinità nell’intervallo nanomolare inferiore utilizzando il glicano dell’involucro senza un dominio transmembrana. Nel presente studio, il legame della glicoproteina monomerica multispecifica CV-N alla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) è misurato a K D = 18,6 μM rispetto al nanomolare K_D a quegli altri picchi virali e attraverso il suo dominio di legame del recettore nell’intervallo medio-μ-molare.

Introduction

L’attività antivirale associata alla terina è indotta dall’interferone-α e comprende legami a base di proteine, che portano alla ritenzione di virioni completamente formati sulle superfici cellulari infette¹. La necessità della glicosilazione della teterina nell’inibizione del rilascio del virus rimane incerta, il che implica l’importanza dei pattern di glicosilazione sui glicani espressi in modo ricombinante per gli studi in vitro ^1,2, che dipende dalla conformazione dell’emoagglutinina ^{HA 3,4} dell’influenza espressa in superficie (nel caso del virus dell’influenza) . È stato notato che la modifica dell’oligosaccaride legato alla glicosilazione legata all’N è sufficiente per la restrizione tetherin-mediata dell’HIV di tipo 1 rilascio², mentre la dimerizzazione svolge un ruolo essenziale nel prevenire il rilascio del virus, coinvolgendo così il dominio transmembrana o l’ancora glicosil-fosfatidil-inositolo (GPI) per legare i virioni in erba⁵ . Sono descritte caratteristiche uniche per il tetherin umano e murino per bloccare più virus, retrovirus e filovirus con involucro. BST-2/tetherin è una proteina antivirale inducibile dall’interferone dell’immunità innata^1,6, che agisce con attività antivirale ad ampio spettro ed è antagonizzata dalle glicoproteine dell’involucro⁵ per traslocare tetherin o interrompere la struttura della tetherin ⁶. Ad esempio, la glicoproteina HA dell’involucro espressa in superficie e la neuraminidasi sul virus dell’influenza A sono ben note per l’antagonismo delle teterine in modo specifico del ceppo 7, facilitando il riconoscimento dei siti di legame^del recettore ospite⁸. Gli anticorpi mirati ai glicani sono studiati nella stechiometria delle loro interazioni con gli scudi glicani in rapida personalizzazione sull’HA, con conseguente affinità di legame con l’influenza A H3N2 e H1N1 sottotipi⁴.

Per chiarire i meccanismi di legame tra agenti antivirali e picchi di involucro virale, cioè ligandi di carboidrati, e metodi immunologici e spettroscopici complementari, vengono sintetizzate chimicamente porzioni mono-, di- e tri-mannosio. I peptidi mannosilati sono creati tramite glicosilazione azidica dei glicosil {beta}-peracetati alla trasformazione 1,2-trans glicosil azide⁹, imitando la N-acetil glucosamina e gli oligosaccaridi ad alto mannosio sulla superficie di virus potenzialmente letali. I bioisosteri triazolici sono utilizzati per imitare i legami che formano il residuo mannosilato del peptide HA¹⁰ e facilitare le interazioni sito-specifiche con i derivati antivirali CV-N attorno al secondo punto di glicosilazione N-linked sul dominio di testa dell’HA (HA top con 4 glicani N-linked N54, N97, N181, N301)^8,11,12 . Le interazioni tra acido glutammico (Glu) e arginina (Arg) e il dipolo dell’elica risultante hanno manifestato una buona stabilità sia dei peptidi modello che delle proteine, ma sono visualizzate utilizzando SPR. Se confrontato con il riconoscimento di un singolo sito di glicosilazione sintetizzato chimicamente su HA¹⁰ inibendo direttamente il legame del recettore sulle porzioni dei glicani, una maggiore affinità di una struttura Fc mutata a quattro siti al suo recettore è mostrata per suscitare funzioni effettrici in vivo, rivelando la composizione non correlata dei glicani N-linked attaccati al mutante Fc da determinare meccanicamente¹³.

CV-N mostra attività antivirale contro l’HIV 14,15, l’influenza¹⁶ e il virus Ebola, che è mediata dal legame nanomolare alle modificazioni oligosaccaridiche ad alto mannosio sulle proteine spike dell’involucro^12,17,18,19. Il legame dell’influenza HA a un sito di legame dei carboidrati ad alta affinità (H) in CV-N o due H in CVN2 dimerico legato covalentemente è determinato per avere costanti di dissociazione all’equilibrio (K D) = 5,7 nM (Figura 1A) e K_D = 2,7 nM, rispettivamente. Sia CV-N che CVN2 ospitano altri uno o due siti di legame dei carboidrati a bassa affinità (L) 12,17,20,21. Ebola GP1,2 si lega a 2H di CVN2 con affinità nell’intervallo nanomolare inferiore (K_D = 26 nM). Il legame di CV-N WT a Ebola GP1,2 e HA mostra affinità da K D = 34 nM a K_D = 5,7 nM (A/New York/55/04)¹². Le lectine, come CV-N, che colpiscono specificamente i glicani ad alto mannosio sugli involucri virali, inibiscono ulteriormente la replicazione del virus dell’epatite C, SARS-CoV, herpesvirus, virus Marburg e virus del morbillo²².

La piccola molecola CV-N è stata studiata a fondo per più di 20 anni in quanto si funzionalizza per legare una vasta gamma di virus per inibire l’ingresso virale^16,18. Analisi strutturali e saggi di affinità di legame indicano il cross-linking di due L in un dimero CVN2 scambiato di dominio mediante legame bivalente nell’intervallo micromolare per aumentare l’avidità alle glicoproteine dell’involucro virale^10,19. Il legame selettivo di Manα1-2Manα sui bracci Man(8) D1D3 e Man(9) comprende due siti di legame di affinità diverse situati su protomeri proteici opposti²⁰, raggiungendo così affinità di legame nanomolare (Figura 1B). Pertanto, CVN2 è considerato uno pseudo-anticorpo per quanto riguarda la sua applicazione per legare epitopi su HIV gp120, simile agli anticorpi neutralizzanti il virus¹⁷. Qui, l’autore è interessato a studiare il potenziale legame di CVN2 al picco SARS-CoV-2 attraverso il suo dominio di legame del recettore (RBD). Le curve di legame dell’enzima di conversione dell’angiotensina umana immobilizzata (ACE)-2 con il SARS-CoV-2 RBD danno come risultato K_D = 4,7 nM per questa interazione di legame biologicamente rilevante²³.

Al contrario, classi di immunoglobuline selezionate riconoscono modelli proteici strutturali specifici e coerenti, che conferiscono un substrato per la maturazione dell’affinità nelle regioni HA ancorate alla membrana²⁴. CV-N mostra un’attività molto potente in quasi tutti i virus dell’influenza A e B¹⁶ ed è un agente antivirale ampiamente neutralizzante. Le nostre conoscenze sono incomplete sulla posizione di epitopi mirati sul gambo di HA1 e HA2 che potrebbero coinvolgere strutture epitopiche per il targeting dei glicani da anticorpi altamente neutralizzanti e rispetto al legame della lectina²⁵.

Figura 1: Rappresentazione schematica del saggio di legame SPR per CV-N ai picchi dell’involucro virale. (A) Saggio SPR per il legame CV-N al ligando: proteina a lunghezza intera HA (90 kDa). Set di dati cinetici (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 0 nM) che mostrano in tempo reale il doppio legame con l’influenza HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 variante V2 che si lega al ligando immobilizzato DM entro un intervallo di concentrazione compreso tra 500 nM e 16 μM. Sequenza: i residui di L sono evidenziati in giallo. I residui di H sono evidenziati in grigio. E58 e R73 sono un sostituto delle cisteine nella proteina wildtype e rendono V2 una piega proteica stabile con tre invece di quattro legami disolfuro Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Mentre lo scudo glicano sulla parte superiore distale della membrana HA induce un legame ad alta affinità con CV-N 12, il legame CVN2 all’HA adiacente a un ponte disolfuro della parte superiore dell’HA è stato ulteriormente osservato nei suoi siti a bassa affinità^10,12. Varie interazioni polari e siti di interazione sono identificati nel legame dei carboidrati da CV-N. Queste interazioni sono verificate generando varianti knock-out nel sito di legame per correlare le affinità di legame alla glicosilazione 12 prevista in silico. Pertanto, il progetto mira a confrontare peptidi HA mannosilati chimicamente precedentemente testati in affinità e specificità di legame con brevi sequenze peptidiche da picchi di 2019-nCoV correlati al SARS e SARS-CoV-2, presenti in natura modificati da un piccolo numero di diversi siti di glicosilazione N-linked e glicosilazione O-linked. Utilizzando la microscopia crioelettronica e saggi di legame, Pinto e collaboratori riportano un anticorpo monoclonale, S309, che potenzialmente riconosce un epitopo sulla proteina spike SARS-CoV-2 contenente un glicano conservato all’interno del sottogenere Sarbecovirus, senza competere con l’attaccamento del recettore²⁶. Il protocollo di questo studio descrive come la progettazione, l’espressione e la caratterizzazione delle varianti di CV-N siano importanti per studiare come CV-N e CVN2 si legano alle proteine glicosilate e ai peptidi mannosilati sintetici utilizzando la tecnologia SPR^10,12.

Il dimero legato al tandem CVN2L0²⁷ e le varianti del sito di legame (V2-V5) sono espressi in modo ricombinante e le varianti sono con sostituzioni del legame disolfuro (C58E e C73R) (Figura 2A). Inoltre, un mutante con una mutazione a punto singolo E41A è preparato perché questa posizione è stata vista come un residuo intermolecolare cross-contact. Questo mutante è un’altra molecola interessante per le misure di legame SPR tra la lectina e gli oligosaccaridi ad alto mannosio che decifra i domini di legame e consente il confronto con la forma dimerica. La struttura cristallina di CVN2 mostra un linker flessibile, che si estende tra 49 e 54 residui. I due domini possono continuare a muoversi attorno alla cerniera come corpi rigidi, sviluppando un monomero attraverso interazioni intramolecolari (dominio A -residui 1-39;90-101- con dominio B -residui 40-89) o un dimero mediante scambio di dominio intermolecolare [dominio A (del primo monomero) con dominio B (del secondo) e dominio B (del primo monomero) con dominio A (della seconda copia)]. Non ci sono interazioni strette tra i domini A e B dei due protomeri, ad eccezione di Glu41²⁸. Il gene per CV-N può essere sviluppato utilizzando un metodo PCR ripetitivo con oligo sintetizzati 40-mer²⁹ e viene quindi subclonato nei siti NdeI e BamHI di pET11a per la trasformazione (elettroporazione) in cellule elettrocompetenti come descritto da Keeffe, J.R.27. La proteina, che viene utilizzata per ottenere la rispettiva struttura cristallina (PDB ID 3S3Y), include un tag di purificazione N-terminale 6-istidina seguito da un sito di scissione della proteasi del fattore Xa. La mutagenesi sito-diretta viene utilizzata per fare mutazioni puntiformi, cambiare codoni e inserire o eliminare basi o codoni singoli o multipli per lo scambio di amminoacidi. Queste trasformazioni forniscono informazioni preziose sulla funzione e la struttura delle proteine. CV-N, CVN2 e CVN3 espressi e purificati in modo ricombinante sono stati biofisicamente ben studiati^20,21,27, sono economici da produrre e quindi utilizzati per caratterizzare saggi di legame ai glicani immobilizzati su chip di sensori SPR. Il saggio di immunoassorbimento enzimatico convenzionale (ELISA) fornisce una minore riproducibilità per quanto riguarda la tecnica di immobilizzazione dei ligandi glicani e trasforma il legame in tempo reale di varie varianti del sito di legame, che viene mostrato per SPR, in saggi endpoint.

La variante di affinità di legame CVN2L0-V2 (una piega intatta di CV-N omodimerico con una sostituzione del ponte disolfuro¹⁰) è espressa con un His-tag in Escherichia coli (E. coli), purificata su colonna Ni-NTA applicando cromatografia di affinità e testata per il legame con HA (H3N2), peptide HA monomannosilato e peptide HA dimannosilato usando SPR. I peptidi mannosilati chimicamente, o proteine HA e S, sono tutti ligandi e ammina accoppiati alla superficie del chip idrofilo tramite esteri reattivi o ingegneria proteica biotina-streptavidina. La stessa procedura di esecuzione sequenziale viene applicata a questi ligandi, iniettando varie diluizioni di CV-N e varianti di CV-N (e CVN2) per ottenere informazioni cinetiche per le analisi di interazione molecolare come descritto di seguito³⁰. Il chip sensore SPR immobilizzato RBD viene utilizzato per studi di legame sui peptidi CV-N a S e le affinità vengono confrontate con il legame SARS-CoV-2 con l’ACE2 umano.

Protocol

Per il presente studio, una proteina di fusione CVN-small ubiquitina-like modifier (SUMO) è stata utilizzata nei saggi di immunoassorbimento enzimatico invece di CV-N ed è adatta per saggi basati su cellule. La proteina H3 ricombinante a lunghezza intera del virus dell’influenza A HA è ottenuta commercialmente (vedi tabella dei materiali) o espressa in linee cellulari HEK293 di mammiferi e cellule di insetti infettate da baculovirus secondo i protocolli standard12. La proteina …

Representative Results

Una molecola CVN2L0 scambiata di dominio dimerico viene testata per il legame alla regione superiore dell’HA in tre esperimenti SPR separati e l’affinità di legame è presentata in valori KD. Si presume che il dominio B comprenda siti di legame H, che sono influenzati dalla sostituzione di un legame disolfuro in residui ionici, e il dominio A forma L10,18. Le singole iniezioni di CVN2L0 e delle varianti V2 (tre ponti disolfuro) e V5 (due ponti disolfu…

Discussion

L’affinità di legame di CV-N è correlata al numero di siti di legame funzionali [2H sui domini B e 2L sui domini A quando progettati come dimero scambiati di dominio]. Una variante con un’alterata affinità di legame (CVN2L0-V2, una piega omodimerica stabile di CV-N comprendente un knock-out del ponte disolfuro) è espressa in E. coli, purificata e testata positivamente per il legame alla proteina HA (H3N2) usando SPR¹⁰, e mostra un cambiamento conformazionale dopo aver legato HA con si…

Materials

Äkta primeplus	Cytiva
Amicon tubes	Merck	C7715
Ampillicin	Sigma-Aldrich	A5354
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge	Beckman Coulter	B06320
Cell spreader	Sigma-Aldrich	HS86655	silver stainless steel, bar L 33 mm
Custom DNA Oligos	Sigma-Aldrich	OLIGO
Custom Gensynthesis	GenScript	#1390661	cloning vector: pET27b(+)
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL	Thermo Scientific	50-105-5354
Dionex UlitMate 3000	Thermo Scientific	IQLAAAGABHFAPBMBFB
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL)	Fisher Scientific	ER1701
DTT	Merck	DTT-RO
EDC	Merck	39391
EDTA	Merck	E9884
Eppendorf Safe-Lock Tubes	Eppendorf	30120086
Eppendorf Safe-Lock Tubes	Eppendorf	30120094
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge	Sigma-Aldrich	Z606235
Ethanol	Merck	51976
Ethanolamine HCl	Merck	E6133
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack	Corning	352057
Glucose	Merck	G8270
Glycine HCl	Merck	55097
HA H3 protein	Abcam	ab69751
HEPES	Merck	H3375
His-select Ni2+	Merck	H0537
Imidazole	Merck	I2399
IPTG	Merck	I6758
Kanamycin A	Sigma-Aldrich	K1377
Kromasil 300-5-C4	Nouryon
LB agar	Merck	52062
LB agar	Merck	19344
LB Lennox	Merck	L3022
Lysozyme	Merck	10837059001
Magnesium chloride	Merck	M8266
Magnesium sulfate	Merck	M7506
NaH2P04	Merck	S0751
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000CLAPTOP
NaOH	Merck	S5881
NHS	Merck	130672
NZ amine (casein hydrolysate)	Merck	C0626
PBS	Merck	806552
PD MidiTrap G-10	Sigma-Aldrich	GE28-9180-11
Peptone	Merck	70171
pET11a	Merck Millipore (Novagen)	69436
PMSF	Merck	PMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)	Qiagen	27106X4
Reichert Software Package Autolink1-1-9	Reichert
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System	Reichert
Scrubber2-2012-09-04 for data analysis	Reichert
SDS	Merck	11667289001
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid	Stratagene	#200518
Sodim chloride	Merck	S9888
Sodium acetate.Trihydrate	Merck	236500
SPR sensor chip C19RBDHC30M	XanTec bioanalytics	SCR C19RBDHC30M
SPR sensor chip CMD500D	XanTec bioanalytics	SCR CMD500D
Sterilin Standard 90mm Petri Dishes	Thermo Scientific	101R20
TBS	Merck	T5912	10x, solution
Triton-X100	Merck	T8787
Tryptone	Merck	93657
Tween20	Merck	P1379
Vortex-Genie 2 Mixer	Merck	Z258423
X-gal	Merck	XGAL-RO
XL1-Blue Supercompetent Cells	Stratagene	#200236
Yeast extract	Merck	Y1625