Mevcut protokol, HA, S glikoproteini, ilgili hibrid tip glikanlar ve yüksek mannoz oligosakkaritlerine CV-N bağlanmasını incelemek için SPR bağlanma testleri için yeni araçları açıklamaktadır. SPR, bu glikanlara dimerik veya monomerik CV-N’yi bağlamak için KD’yi belirlemek için kullanılır.
Yüzey plazmon rezonansı (SPR), etki alanı ile değiştirilen Siyanovirin-N (CV-N) DIMERINE HEMAGLUTININ (HA) BAĞLANMASıNı ÖLÇMEK VE MANNOSILLENMIŞ PEPTITLER ILE CV-N’nin yüksek afiniteli bağlanma bölgesi arasındaki etkileşimleri izlemek için kullanılır. Virüs zarfı sivri uçları gp120, HA ve Ebola glikoprotein (GP) 1,2’nin dimerik CVN2 üzerinde hem yüksek hem de düşük afiniteli bağlanma bölgelerine bağlandığı bildirilmiştir. Dimannosile HA peptidi ayrıca iki düşük afiniteli bağlanma bölgesinde, ilgili ligand için yüksek afiniteli bir bölge taşıyan ve karbonhidrat bağlayıcı cepteki stabilize edici bir disülfür bağının yerini almak için mutasyona uğrayan ve böylece çok değerli bağlanmayı doğrulayan mühendislik ürünü bir CVN2 molekülüne bağlanır. HA bağlanması, oligomerizasyon yoluyla insan immün yetmezlik virüsü tip 1’i (HIV-1) daha da nötralize eden 275 nM’lik bir ayrışma sabitinde (KD) psödo-antikor CVN2’nin yüksek afiniteli bir bağlanma bölgesine gösterilmiştir. Alan değiştirilmiş CVN2’deki disülfür köprülerinin sayısının ilişkilendirilmesi, sistinlerin polar kalıntı çiftleri glutamik asit ve arginin ile değiştirilmesiyle 4’ten 2’ye düşürülür, bu da HA’ya bağlanma afinitesinin azalmasına neden olur. En güçlü etkileşimler arasında, Ebola GP1,2, transmembran alanı olmayan zarf glikanını kullanarak alt nanomolar aralıkta iki yüksek afiniteli bağlanma bölgesi olan CVN2 ile bağlanır. Bu çalışmada, multispesifik monomerik CV-N’nin şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) başak (S) glikoproteinine bağlanması, nanomolar KD ile karşılaştırıldığında diğer virüs sivri uçlarına kıyasla KD = 18.6 μM’de ve orta μ-molar aralığındaki reseptör bağlama alanı aracılığıyla ölçülmüştür.
Teterin ile ilişkili antiviral aktivite, interferon α tarafından indüklenir ve enfekte hücre yüzeylerinde tam olarak oluşturulmuş viryonların tutulmasına yol açan protein bazlı tetherleri içerir1. Virüs salınımının inhibisyonunda tetherin glikozilasyonun gerekliliği belirsizliğini korumaktadır, bu da in vitro çalışmalar için rekombinant olarak eksprese edilen glikanlar üzerinde glikozilasyon paternlerinin önemini ima etmektedir1,2, (influenza virüsü durumunda) yüzeyde eksprese edilen influenza hemaglutinin HA 3,4’ün konformasyonuna bağlıdır. . N’ye bağlı glikozilasyona bağlı oligosakkaritin modifikasyonunun, HIV tip-1 salınım2’nin tetherin aracılı kısıtlaması için yeterli olduğu, dimerizasyonun virüs salınımını önlemede önemli bir rol oynadığı, böylece tomurcuklanan viryonları bağlamak için transmembran alanını veya glikozil-fosfatidil-inositol (GPI)-çapayı içerdiği belirtilmiştir5 . İnsan ve murin tetherininin birden fazla zarflı virüsü, retrovirüsleri ve filovirüsleri bloke etmesi için benzersiz özellikler tanımlanmıştır. BST-2 / tetherin, doğuştan gelen bağışıklık 1,6’nın interferon ile indüklenebilen bir antiviral proteinidir, geniş spektrumlu antiviral aktivite ile etki eder ve tetherini translokasyona sokmak veya tetherin 6’nın yapısını bozmak için zarf glikoproteinleri5 tarafından antagonize edilir. Örneğin, influenza A virüsü üzerinde yüzeyde eksprese edilen zarf glikoprotein HA ve nöraminidaz tetherin antagonizması için suşa özgü bir şekildeiyi bilinir 7, konakçı reseptör bağlanma bölgelerinin tanınmasını kolaylaştırır8. Glikan hedefleme antikorları, HA üzerindeki hızla özelleştirilen glikan kalkanları ile etkileşimlerinin stokiyometrisinde incelenmiştir, bu da influenza A H3N2 ve H1N1 alt tiplerine bağlanma afinitesi ile sonuçlanır4.
Antiviral ajanlar ile virüs zarfı sivri uçları, yani karbonhidrat ligandları ve tamamlayıcı immünolojik ve spektroskopik yöntemler arasındaki bağlanma mekanizmalarını aydınlatmak için mono-, di- ve tri-mannoz moieties kimyasal olarak sentezlenir. Mannosillenmiş peptitler, glikozil {beta}-perasetatların azido glikozilasyonu yoluyla 1,2-trans glikozil azid transformasyonu9’a kadar oluşturulur ve tipik olarak bulunan N-asetil glukozamin ve hayatı tehdit eden virüslerin yüzeyinde yüksek mannoz oligosakkaritlerini taklit eder. Triazol biyoisosterleri, HA peptid10’un mannosillenmiş kalıntısını oluşturan bağlantıları taklit etmek ve HA kafa alanındaki ikinci N-bağlantılı glikozilasyon noktası etrafında antiviral CV-N türevleri ile bölgeye özgü etkileşimleri kolaylaştırmak için kullanılır (4 N-bağlantılı glikan N54, N97, N181, N301 ile HA tepesi)8,11,12 . Glutamik asit (Glu) ve arginin (Arg) ve sonuçta ortaya çıkan sarmal dipol arasındaki etkileşimler, hem model peptitlerin hem de proteinlerin iyi stabilitesini göstermiştir, ancak SPR kullanılarak görselleştirilmiştir. Glikan moietilerine reseptör bağlanmasını doğrudan inhibe ederek HA10 üzerinde kimyasal olarak sentezlenmiş tek bir glikozilasyon bölgesini tanımakla karşılaştırılırsa, dört bölgeli mutasyona uğramış bir Fc yapısının reseptörüne daha yüksek bir afinitesinin in vivo olarak efektör fonksiyonlarını ortaya çıkardığı ve Fc mutantına bağlı N-bağlı glikanların ilgisiz bileşiminin mekanik olarak belirlendiğini ortaya koyduğu gösterilmiştir13.
CV-N, HIV 14,15, influenza16 ve Ebola virüsüne karşı antiviral aktivite gösterir; bu, zarf başak proteinleri12,17,18,19 üzerindeki yüksek mannoz oligosakkarit modifikasyonlarına nanomolar bağlanmanın aracılık ettiği bir durumdur. CV-N’de bir yüksek afiniteli karbonhidrat bağlanma bölgesine (H) veya kovalent olarak bağlı dimerik CVN2’de iki Hs’ye bağlanan influenza HA’nın sırasıyla denge ayrışma sabitlerine (K D) = 5.7 nM (Şekil 1A) ve KD = 2.7 nM’ye sahip olduğu belirlenmiştir. Hem CV-N hem de CVN2, bir veya iki düşük afiniteli karbonhidrat bağlama bölgesini (L)12,17,20,21 olarak barındırır. Ebola GP1,2, CVN2’nin 2H’sine alt nanomolar aralıkta (KD = 26 nM) afinitelerle bağlanır. Ebola GP1,2 ve HA’ya bağlanan CV-N WT, KD = 34 nM’den KD = 5.7 nM’ye (A / New York / 55/04) 12 arasında yakınlıklar gösterir. Özellikle viral zarflar üzerindeki yüksek mannoz glikanlarını hedef alan CV-N gibi lektinler, hepatit C virüsü, SARS-CoV, herpes virüsü, Marburg virüsü ve kızamık virüsü22’nin replikasyonunu daha da inhibe eder.
Küçük CV-N molekülü, viral girişi inhibe etmek için çok çeşitli virüsleri bağlamak için işlevselleştirildiği için 20 yıldan fazla bir süredir kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır16,18. Yapısal analizler ve bağlanma afinite testleri, viral zarf glikoproteinlerine olan tutkuyu arttırmak için mikromolar aralıkta iki valan bağlanma ile alan değiştirilmiş bir CVN2 dimerindeki iki L’nin çapraz bağlandığını göstermektedir10,19. Manα1-2Manα’nın Man(8) D1D3 kolları ve Man(9) üzerindeki seçici bağlanması, karşıt protein protomerleri20 üzerinde bulunan farklı afinitelerin iki bağlanma bölgesini içerir ve böylece nanomolar bağlanma afinitelerine ulaşır (Şekil 1B). Bu nedenle, CVN2, virüs nötralize edici antikorlara benzer şekilde, HIV gp120 üzerindeki epitopları bağlamak için uygulanmasıyla ilgili olarak psödo-birantikor olarak kabul edilir. Burada yazar, CVN2’nin reseptör bağlama alanı (RBD) aracılığıyla SARS-CoV-2 spike’ına potansiyel bağlanmasını araştırmakla ilgilenmektedir. İmmobilize insan anjiyotensin dönüştürücü enziminin (ACE)-2’nin SARS-CoV-2 RBD ile bağlanma eğrileri, biyolojik olarak ilgili bu bağlanma etkileşimi için KD = 4.7 nM ile sonuçlanır23.
Buna karşılık, seçilen immünoglobulin sınıfları, membrana implante HA bölgelerinde afinite olgunlaşması için bir substrat veren spesifik ve tutarlı yapısal protein paternlerini tanır24. CV-N, hemen hemen tüm influenza A ve B virüsleri16’da oldukça güçlü aktivite gösterir ve geniş ölçüde nötralize edici bir antiviral ajandır. HA1 ve HA2’nin gövdesi üzerinde, muhtemelen yüksek oranda nötralize edici antikorlarla glikan hedefleme için epitopik yapıları içeren ve lektin bağlayıcı25 ile karşılaştırıldığında, hedeflenen epitopların yeri hakkında bilgimiz eksiktir.
Şekil 1: CV-N için SPR bağlanma testinin virüs zarfı sivri uçlarına şematik gösterimi. (A) CVV-N’nin ligandaya bağlanması için SPR Testi: HA tam uzunlukta protein (90 kDa). Kinetik veri seti (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM) influenza HA A/New-York/55/04 (H3N2) ile gerçek zamanlı çift referanslı bağlanmayı göstermektedir. (B) CVN2L0 varyantı V2, 500 nM ila 16 μM konsantrasyon aralığında hareketsiz ligand DM’ye bağlanır. H kalıntıları gri renkle vurgulanır. E58 ve R73, vahşi tip proteindeki sisteinlerin yerine geçer ve V2’yi dört disülfür bağı yerine üç ile kararlı bir protein kıvrımı yapar Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Membran-distal HA üst kısmındaki glikan kalkanı CV-N 12’ye yüksek afiniteli bağlanmayı indüklerken, HA üst kısmının disülfür köprüsüne bitişik olarak HA’ya bağlanan CVN2, düşük afiniteli bölgelerinde10,12’de daha fazla gözlenmiştir. CV-N ile karbonhidrat bağlanmasında çeşitli polar etkileşimler ve etkileşim bölgeleri tanımlanmıştır. Bu etkileşimler, bağlanma afinitelerini in siliko öngörülen glikozilasyon12 ile ilişkilendirmek için bağlanma bölgesinde nakavt varyantları üretilerek doğrulanır. Bu nedenle, proje, bağlanma afinitesi ve özgüllüğünde daha önce test edilmiş kimyasal olarak mannosillenmiş HA peptidlerini, SARS ile ilişkili 2019-nCoV sivri uçlarından ve SARS-CoV-2’den elde edilen kısa peptid dizileri ile karşılaştırmayı amaçlamaktadır. doğal olarak az sayıda farklı N-bağlı glikozilasyon bölgesi ve O’ya bağlı glikozilasyon ile modifiye edilmiştir. Kriyo-elektron mikroskobu ve bağlayıcı testler kullanarak, Pinto ve meslektaşları, Sarbecovirus alt cinsi içinde korunmuş bir glikan içeren SARS-CoV-2 spike proteini üzerindeki bir epitopu potansiyel olarak tanıyan bir monoklonal antikor olan S309’u raporettiler. Bu çalışmanın protokolü, CV-N ve CVN2’nin SPR teknolojisi10,12 kullanılarak glikozile proteinlere ve sentetik mannosillenmiş peptitlere nasıl bağlandığını incelemek için CV-N varyantlarının tasarlanması, eksprese edilmesi ve karakterize edilmesinin ne kadar önemli olduğunu açıklamaktadır.
Tandem bağlantılı dimer CVN2L027 ve bağlanma yeri varyantları (V2-V5) rekombinant olarak eksprese edilir ve varyantlar disülfit bağ replasmanları (C58E ve C73R) ile birlikte (Şekil 2A). Ayrıca, tek noktalı mutasyon E41A’ya sahip bir mutant hazırlanır, çünkü bu pozisyon moleküller arası çapraz temas kalıntısı olarak görülmüştür. Bu mutant, lektin ve yüksek mannoz oligosakkaritler arasındaki SPR bağlanma ölçümleri için bağlanma alanlarını deşifre eden ve dimerik form ile karşılaştırmaya izin veren bir başka ilginç moleküldür. CVN2’nin etki alanı ile değiştirilen kristal yapısı, 49 ila 54 kalıntı arasında uzanan esnek bir bağlayıcı gösterir. İki alan, menteşe etrafında katı cisimler olarak hareket etmeye devam edebilir, ya molekül içi etki alanı etkileşimleri yoluyla bir monomer geliştirebilir (alan A -kalıntıları 1-39; 90-101- B alanı -kalıntıları 40-89 ile) ya da moleküller arası etki alanı [etki alanı A (ilk monomerin) B alanı (ikinci) ile ve B alanı (ilk monomerin) A alanı (ikinci kopyanın) ile] değiştirilerek bir dimer geliştirir. İki protomerin A ve B alanları arasında, Glu4128 hariç, yakın bir etkileşim yoktur. CV-N geni, 40-mer sentezlenmiş oligolar29 ile tekrarlayan bir PCR yöntemi kullanılarak geliştirilebilir ve daha sonra Keeffe, J.R.27 tarafından tanımlandığı gibi elektroremejyen hücrelere transformasyon (elektroporasyon) için pET11a’nın NdeI ve BamHI bölgelerine alt klonlanır. İlgili kristal yapıya (PDB ID 3S3Y) ulaşmak için kullanılan protein, bir N-terminal 6-histidin saflaştırma etiketi ve ardından bir Faktör Xa proteaz bölünme bölgesi içerir. Bölgeye yönelik mutagenez, nokta mutasyonları yapmak, kodonları değiştirmek ve amino asit değişimi için tek veya çoklu bazlar veya kodonlar eklemek veya silmek için kullanılır. Bu dönüşümler, protein fonksiyonu ve yapısı hakkında paha biçilmez bir fikir verir. Rekombinant olarak eksprese edilen ve saflaştırılan CV-N, CVN2 ve CVN3, biyofiziksel olarak iyi çalışılmış20,21,27, üretilmesi ucuzdur ve bu nedenle SPR sensör çipleri üzerine hareketsiz hale getirilmiş glikanlara bağlanma tahlillerini karakterize etmek için kullanılmıştır. Konvansiyonel enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA), glikan ligandlarının immobilizasyon tekniği ile ilgili daha az tekrarlanabilirlik sağlar ve SPR için gösterilen çeşitli bağlanma yeri varyantlarının gerçek zamanlı bağlanmasını son nokta analizlerine dönüştürür.
Bağlanma-afinite varyantı CVN2L0-V2 (disülfit köprü ikamesi10 ile homodimerik CV-N’nin sağlam bir kıvrımı), Escherichia coli’de (E. coli) bir His-etiketi ile ifade edilir, afinite kromatografisi uygulayan Ni-NTA sütunu üzerinde saflaştırılır ve HA’ya (H3N2) bağlanma için test edilir, monomannosillenmiş HA-peptid ve SPR kullanılarak dimannosile HA-peptid. Kimyasal olarak mannosile edilmiş peptitler veya HA ve S proteini, hepsi hidrofilik çip yüzeyine bağlanmış ligandlar ve amindir. reaktif esterler veya biotin-streptavidin protein mühendisliği yoluyla. Aynı sıralı çalışma prosedürü, aşağıda açıklandığı gibi moleküler etkileşim analizleri için kinetik bilgi elde etmek için çeşitli CV-N seyreltimleri ve CV-N (ve CVN2) varyantları enjekte edilen bu ligandlara uygulanır. RBD-immobilize SPR sensör çipi, CV-N’den S peptidlerine bağlanma çalışmaları için kullanılır ve afiniteler, insan ACE2 ile SARS-CoV-2 bağlanmasıyla karşılaştırılır.
CV-N’nin bağlanma afinitesi, işlevsel bağlama sitelerinin sayısıyla ilişkilidir [B etki alanlarında 2H ve etki alanı değiştirilen dimer olarak tasarlandığında A etki alanlarında 2L]. Değiştirilmiş bağlanma afinitesine sahip bir varyant (CVN2L0-V2, bir disülfit köprü nakavtını içeren CV-N’nin homodimerik kararlı bir kıvrımı) E. coli’de ifade edilir, saflaştırılır ve SPR10 kullanılarak HA-proteinine (H3N2) bağlanma için pozitif olarak test edilir ve HA’nı…
The authors have nothing to disclose.
Yazar, TU Wien’deki Biyoteknoloji ve Mikrobiyoloji Bölümü’nden Dr. Christian Derntl’i ve Viyana Tıp Üniversitesi Tıp Bölümü III, Nefroloji ve Diyaliz Bölümü’nü, özellikle de teknik ve bilimsel destek için Dr. Markus Wahrmann’ı kabul ediyor. Memeli hücrelerinde protein ekspresyonu, Viyana Doğal Kaynaklar ve Yaşam Bilimleri Üniversitesi (BOKU) Biyoteknoloji Bölümü tarafından desteklenmiştir. Yazar, SPR bağlama tahlillerinin gerçekleştirilmesi konusunda yararlı bilimsel tartışmalar için Almanya’nın Duesseldorf kentindeki XanTec biyoanalitiğinden Dr. Nico Dankbar’a derin teşekkürlerini ifade etmek istiyor.
Äkta primeplus | Cytiva | ||
Amicon tubes | Merck | C7715 | |
Ampillicin | Sigma-Aldrich | A5354 | |
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B06320 | |
Cell spreader | Sigma-Aldrich | HS86655 | silver stainless steel, bar L 33 mm |
Custom DNA Oligos | Sigma-Aldrich | OLIGO | |
Custom Gensynthesis | GenScript | #1390661 | cloning vector: pET27b(+) |
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL | Thermo Scientific | 50-105-5354 | |
Dionex UlitMate 3000 | Thermo Scientific | IQLAAAGABHFAPBMBFB | |
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL) | Fisher Scientific | ER1701 | |
DTT | Merck | DTT-RO | |
EDC | Merck | 39391 | |
EDTA | Merck | E9884 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120086 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120094 | |
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge | Sigma-Aldrich | Z606235 | |
Ethanol | Merck | 51976 | |
Ethanolamine HCl | Merck | E6133 | |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack | Corning | 352057 | |
Glucose | Merck | G8270 | |
Glycine HCl | Merck | 55097 | |
HA H3 protein | Abcam | ab69751 | |
HEPES | Merck | H3375 | |
His-select Ni2+ | Merck | H0537 | |
Imidazole | Merck | I2399 | |
IPTG | Merck | I6758 | |
Kanamycin A | Sigma-Aldrich | K1377 | |
Kromasil 300-5-C4 | Nouryon | ||
LB agar | Merck | 52062 | |
LB agar | Merck | 19344 | |
LB Lennox | Merck | L3022 | |
Lysozyme | Merck | 10837059001 | |
Magnesium chloride | Merck | M8266 | |
Magnesium sulfate | Merck | M7506 | |
NaH2P04 | Merck | S0751 | |
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | |
NaOH | Merck | S5881 | |
NHS | Merck | 130672 | |
NZ amine (casein hydrolysate) | Merck | C0626 | |
PBS | Merck | 806552 | |
PD MidiTrap G-10 | Sigma-Aldrich | GE28-9180-11 | |
Peptone | Merck | 70171 | |
pET11a | Merck Millipore (Novagen) | 69436 | |
PMSF | Merck | PMSF-RO | |
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) | Qiagen | 27106X4 | |
Reichert Software Package Autolink1-1-9 | Reichert | ||
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System | Reichert | ||
Scrubber2-2012-09-04 for data analysis | Reichert | ||
SDS | Merck | 11667289001 | |
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid | Stratagene | #200518 | |
Sodim chloride | Merck | S9888 | |
Sodium acetate.Trihydrate | Merck | 236500 | |
SPR sensor chip C19RBDHC30M | XanTec bioanalytics | SCR C19RBDHC30M | |
SPR sensor chip CMD500D | XanTec bioanalytics | SCR CMD500D | |
Sterilin Standard 90mm Petri Dishes | Thermo Scientific | 101R20 | |
TBS | Merck | T5912 | 10x, solution |
Triton-X100 | Merck | T8787 | |
Tryptone | Merck | 93657 | |
Tween20 | Merck | P1379 | |
Vortex-Genie 2 Mixer | Merck | Z258423 | |
X-gal | Merck | XGAL-RO | |
XL1-Blue Supercompetent Cells | Stratagene | #200236 | |
Yeast extract | Merck | Y1625 |