マウス小腸上皮オルガノイドと先天性リンパ球細胞との共培養
Summary
このプロトコルは、マウス小腸オルガノイドの樹立、マウス小腸固有層からの1型先天性リンパ系細胞の単離、および腸上皮細胞と1型先天性リンパ系細胞との間の双方向相互作用を研究するための両方の細胞型間の3次元(3D)共培養を確立するための詳細な指示を提供する。
Abstract
オルガノイドと免疫細胞との複雑な共培養は、粘膜恒常性の微妙なバランスを支える双方向相互作用を調査するための汎用性の高いツールを提供します。これらの3D多細胞システムは、多因子疾患に対処し、組織常駐先天性リンパ球細胞(ILC)などの希少細胞型を研究する際に生じる技術的困難を解決するための還元主義モデルを提供します。この記事では、小腸オルガノイドと小腸粘膜固有層由来ヘルパー様1型ILC(ILC1s)を組み合わせたマウス系について説明し、他のILCまたは免疫集団に容易に拡張することができる。ILCは、粘膜に特に富む組織常駐集団であり、恒常性を促進し、損傷または感染に迅速に反応する。ILCとのオルガノイド共培養は、腸内の新しい上皮免疫シグナル伝達モジュールにすでに光を当て始めており、異なるILCサブセットが腸上皮バリアの完全性と再生にどのように影響するかを明らかにしています。このプロトコルは、粘膜恒常性と炎症のメカニズムに関する新しい洞察を提供する可能性を秘めた上皮細胞と免疫細胞との間の相互相互作用のさらなる研究を可能にする。
Introduction
腸上皮と腸常駐免疫系との間のコミュニケーションは、腸の恒常性の維持の中心である1。これらの相互作用の中断は、炎症性腸疾患(IBD)および胃腸癌を含む局所疾患および全身性疾患の両方と関連している2。ホメオスタシスの重要な調節因子の注目すべき例は、腸の免疫ランドスケープにおける主要なプレーヤーとして出現した先天性リンパ球細胞(ILC)の研究から来ている3。ILCは、腸の恒常性を調節し、主にサイトカイン媒介シグナル伝達を介して炎症を調節する異種自然免疫細胞のグループである4。
マウスILCは、転写因子、受容体、およびサイトカイン発現プロファイルに基づいてサブタイプに大別される5。細胞傷害性ナチュラルキラー(NK)細胞およびヘルパー様1型ILC(ILC1s)を含む1型ILCは、それぞれT細胞(T-bet)6で発現される転写因子(エオメソダーミン)EomesおよびT-boxタンパク質の発現によって定義され、Tヘルパー1型(TH1)免疫に関連するサイトカインを分泌する:インターフェロン-γ(IFNγ)および腫瘍壊死因子(TNF)は、インターロイキン(IL)-12に応答して、 IL-15およびIL-187.恒常性維持の間、組織常駐型ILC1はトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)を分泌し、上皮増殖およびマトリックスリモデリングを促進する8。2型ILC(ILC2s)は、主にTヘルパー2型(TH2)関連サイトカイン(IL-4、IL-5、およびIL-13)の分泌を介して蠕虫感染に応答し、レチノイン酸関連オーファン受容体(ROR)α(ROR-α)9およびGATA結合タンパク質3(GATA-3)の発現によって特徴付けられる10、11、12.マウスにおいて、腸管「炎症性」ILC2sは、キラー細胞レクチン様受容体(サブファミリーGメンバー1、KLRG)13の発現によってさらに特徴付けられ、そこでは上皮房細胞由来IL−25に応答する14、15。最後に、リンパ組織誘導細胞およびヘルパー様3型ILC(ILC3s)を含む3型ILCは、転写因子ROR-γt16に依存しており、局所IL-1βおよびIL-23シグナルに応答して顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、IL-17、またはIL-22のいずれかを分泌する群にクラスター化される17。リンパ組織誘導細胞はパイエル板に集積し、発生中のこれらの二次リンパ器官の発達に重要である18が、ILC3は成体マウス小腸粘膜固有層において最も豊富なILCサブタイプである。ILC3sを用いた最古のマウス腸管オルガノイド共培養系の1つは、再生ILC-上皮相互作用の強力な例であるGタンパク質共役受容体5(Lgr5)+腸幹細胞増殖19を含む転写3(STAT-3)のシグナルトランスデューサおよびアクチベーターに対するサイトカインIL-22の影響を引き離すために利用された。ILCは、器官20,21間にインプリント不均一性を示し、分極サイトカイン22に応答してサブセット間で可塑性を示す。これらの組織特異的な痕跡と可塑性の違いを駆動するもの、およびIBD23などの慢性疾患においてそれらが果たす役割は、オルガノイド共培養を使用して対処できるエキサイティングなトピックのままです。
腸管オルガノイドは、腸上皮を研究するための成功し、信頼できるモデルとして浮上している24、25。これらは、腸上皮Lgr5+幹細胞、またはWntファミリーメンバー3A(Wnt3a)の内因性供給源としてパネス細胞を含む単離された陰窩全体を培養することによって生成される。これらの3D構造は、合成ヒドロゲル26または基底粘膜固有層を模倣する生体材料、例えば熱架橋基礎細胞外マトリックス(TBEM)のいずれかで維持され、さらに周囲のニッチを模倣する成長因子、特に上皮成長因子(EGF)、骨形成タンパク質(BMP)阻害剤ノギン、およびLgr5リガンドおよびWntアゴニストR-Spondin127で補充される。.これらの条件下では、オルガノイドは上皮アピコ基底極性を維持し、オルガノイドの中心で吸収性および分泌性細胞に最終的に分化する出芽幹細胞陰窩を用いて腸上皮の陰窩絨毛構造を反復し、次いでアノイキス28によって内部偽腔に放出される。腸オルガノイドだけでも、上皮の発達とダイナミクスの還元主義モデルとして非常に有利であったが29,30、これらの行動が免疫区画によってどのように調節され、影響を受け、あるいは破壊されるかを理解するための途方もない将来の可能性を秘めている。
以下のプロトコールでは、マウス小腸オルガノイドと固有層由来ILC1sとの間の共培養の方法が記載されており、これは最近、この集団が炎症の腸シグネチャを予期せず減少させ、代わりにこのシステムにおけるTGF−β を介 した上皮増殖の増加に寄与する方法を特定するために使用された8。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、マウス小腸オルガノイドを確立し、腸解離プロトコル中のリンパ球の損失を最小限に抑えることによって希少ILC1を単離し、これら2つのコンパートメント間の共培養を確立するための方法を記述している。このプロトコルには多くのステップがあり、ILC1に固有のものもありますが、このアプローチは他の腸管免疫細胞タイプにも適用でき、共培養セットアップは個々の研?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.R.はウェルカム・トラスト(215027/Z/18/Z)の博士号取得を認めています。G.M.J.はウェルカム・トラスト(203757/Z/16/A)の博士課程フェローシップを認めています。ワシントンD.C.は、NIHR GSTBから博士号を取得していることを認めています。J.F.N.は、マリー・スクウォドフスカ・キュリー・フェローシップ、キングス・プライズ・フェローシップ、RCUK/UKRIラザフォード基金フェローシップ(MR/R024812/1)、ウェルカム・トラスト(204394/Z/16/Z)の科学におけるシード・アワードを受賞しました。また、ガイズ病院に拠点を置くBRCフローサイトメトリーコアチームにも感謝します。Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6レポーターマウスは、G. Eberl(パスツール研究所、パリ、フランス)からの寛大な贈り物でした。CD45.1 C57BL/6マウスは、T. Lawrence(キングス・カレッジ・ロンドン、ロンドン)とP. Barral(キングス・カレッジ・ロンドン、ロンドン)から親切に与えられた。
Materials
| Reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-mouse CD45 (BV510) | BioLegend | 103137 | |
| Anti-mouse NK1.1 (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-5941-83 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| CD127 Monoclonal Antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-1271-82 | |
| CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0193-82 | |
| CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0051-82 | |
| CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0031-82 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423/10 | |
| COLLAGENASE D, 500MG | Merck | 11088866001 | |
| Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells | Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University) | ||
| DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) | Merck | 4942078001 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) | Gibco | 11320033 | |
| DNASE I, GRADE II | Merck | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) | Gibco | 21969-035 | |
| Ethilenediamine Tetraacetate Acid | Thermo Fisher Scientific | BP2482-100 | |
| FC block | 2B Scientific | BE0307 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated | Gibco | 10500064 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 3050-038 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14065056 | |
| HBSS (1X) | Gibco | 12549069 | |
| HEK-293T- mNoggin-Fc Cells | Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012). | ||
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) | Thermo Fisher Scientific | 46-5893-82 | |
| Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Thermo Fisher Scientific | L23105 | |
| Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-5931-82 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetylcysteine (500mM) | Merck | A9165 | |
| NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) | Thermo Fisher | 25-3351-82 | |
| PBS (1 X) 7.2 pH | Thermo Fisher Scientific | 12549079 | |
| PBS (10X) | Gibco | 70013032 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | |
| Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein | R&D Systems | AFL236 | |
| Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF | R&D Systems | 247-GMP | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier free) | BioLegend | 589106 | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) | R&D Systems | 407-ML-005/CF | |
| UltraComp eBeads | Thermo Fisher Scientific | 01-2222-42 | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Bio-techne | 1254 | |
| Plastics | |||
| 50 mL tube | Falcon | 10788561 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 30121023 | |
| 10 mL pippette | StarLab | E4860-0010 | |
| 15 mL tube | Falcon | 11507411 | |
| 25 mL pippette | StarLab | E4860-0025 | |
| p10 pippette tips | StarLab | S1121-3810-C | |
| p1000 pippette tips | StarLab | I1026-7810 | |
| p200 pippette tips | StarLab | E1011-0921 | |
| Standard tissue culture treated 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| CO2 and temperature controled incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R/S | |
| Flow Assisted Cellular Sorter | BD equipment | FACS Aria II | |
| Heated shaker | Stuart Equipment | SI500 | |
| Ice box | – | – | |
| Inverted light microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000) | |
| p10 pippette | Eppendorf | 3124000016 | |
| p1000 pippette | Eppendorf | 3124000063 | |
| p200 pippette | Eppendorf | 3124000032 | |
| Pippette gun | Eppendorf | 4430000018 | |
| Wet ice | – | – |
Referências
- Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).
- Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis. Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).
- Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
- Vivier, E., et al. Innate lymphoid cells: 10 years on. Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).
- Klose, C. S. N., et al. Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages. Cell. 157 (2), 340-356 (2014).
- Bernink, J. H., et al. Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria. Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).
- Jowett, G. M., et al. ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling. Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).
- Wong, S. H., et al. Transcription factor RORα is critical for nuocyte development. Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).
- Neill, D. R., et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity. Nature. 464, 1367-1370 (2010).
- Mjösberg, J., et al. The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential ‘inflammatory’ type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529, 221-225 (2016).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529, 226-230 (2016).
- Eberl, G., et al. An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells. Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells–a proposal for uniform nomenclature. Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).
- Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells. Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).
- Lindemans, C. A., et al. Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration. Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).
- Meininger, I., et al. Tissue-specific features of innate lymphoid cells. Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).
- Dutton, E. E., et al. Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity. Wellcome Open Research. 2, 117 (2018).
- Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. Plasticity of innate lymphoid cell subsets. Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).
- Bernink, J. H., et al. Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues. Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2012).
- Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).
- Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Biologia do Desenvolvimento. 420 (2), 262-270 (2016).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Tallapragada, N. P., et al. Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids. Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281 (2018).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- O’Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
- Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Cardoso, V., et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).
- Gury-BenAri, M., et al. The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome. Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).
- Seehus, C., Kaye, J. In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells. Bio-protocol. 6 (6), 1770 (2016).
