JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Imunologia e Infecção

Co-kultur af Murine tyndtarmsepitelorganoider med medfødte lymfoide celler

Published: March 23, 2022
doi:
10.3791/63554
, , ,
1Centre for Host-Microbiome Interactions,King’s College London, 2Wellcome Trust Cell Therapies and Regenerative Medicine Ph.D. Programme,King’s College London, 3Present address: Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute,Cambridge University

Summary

Denne protokol indeholder detaljerede instruktioner til etablering af murine tyndtarmsorganoider, isolering af medfødte lymfoidceller af type 1 fra murine tyndtarmen lamina propria og etablering af 3-dimensionelle (3D) co-kulturer mellem begge celletyper for at studere tovejsinteraktioner mellem tarmepitelceller og type 1 medfødte lymfoide celler.

Abstract

Komplekse co-kulturer af organoider med immunceller giver et alsidigt værktøj til at forhøre de tovejs interaktioner, der understøtter den delikate balance i slimhindehomeostase. Disse 3D, multicellulære systemer tilbyder en reduktionistisk model til håndtering af multifaktorielle sygdomme og løsning af tekniske vanskeligheder, der opstår, når man studerer sjældne celletyper såsom vævsresidente medfødte lymfoide celler (ILC’er). Denne artikel beskriver et murinsystem, der kombinerer tyndtarmsorganoider og tyndtarm lamina propria afledt hjælperlignende type 1 ILC’er (ILC1’er), som let kan udvides til andre ILC- eller immunpopulationer. ILC’er er en vævsbeboerpopulation, der er særligt beriget i slimhinden, hvor de fremmer homeostase og hurtigt reagerer på skade eller infektion. Organoide co-kulturer med ILC’er er allerede begyndt at kaste lys over nye epitel-immune signalmoduler i tarmen, hvilket afslører, hvordan forskellige ILC-delmængder påvirker tarmepitelbarrierens integritet og regenerering. Denne protokol vil muliggøre yderligere undersøgelser af gensidige interaktioner mellem epitel- og immunceller, som har potentiale til at give ny indsigt i mekanismerne for slimhindehomeostase og inflammation.

Introduction

Kommunikation mellem tarmepitelet og tarm-resident immunforsvaret er centralt for opretholdelsen af intestinal homeostase1. Forstyrrelser i disse interaktioner er forbundet med både lokale og systemiske sygdomme, herunder inflammatorisk tarmsygdom (IBD) og gastrointestinale kræftformer2. Et bemærkelsesværdigt eksempel på en nyere beskrevet kritisk regulator af homeostase kommer fra undersøgelsen af medfødte lymfoide celler (ILC’er), der er opstået som nøgleaktører i tarmimmunlandskabet3. ILC’er er en gruppe heterogene medfødte immunceller, der regulerer intestinal homeostase og orkestrerer inflammation stort set gennem cytokinmedieret signalering4.

Murine ILC’er er bredt opdelt i undertyper baseret på transkriptionsfaktor,receptor og cytokinekspressionsprofiler5. Type-1 ILC’er, som omfatter cytotoksiske Natural Killer (NK) celler og hjælperlignende type-1 ILC’er (ILC1’er), defineres ved ekspression af transkriptionsfaktoren (eomesodermin) Eomes og T-box protein udtrykt i henholdsvis T-celler (T-bet)6 og udskiller cytokiner forbundet med T-hjælper type-1 (TH1) immunitet: interferon-γ (IFNγ) og tumornekrosefaktor (TNF) som reaktion på interleukin (IL)-12, IL-15 og IL-187. Under homeostase udskiller vævsresidente ILC1’er Transforming Growth Factor β (TGF-β) for at drive epitelproliferation og matrix-ombygning8. Type-2 ILC’er (ILC2’er) reagerer primært på helminthinfektion via sekretion af T-hjælper type-2 (TH2) associerede cytokiner: IL-4, IL-5 og IL-13 og er karakteriseret ved ekspression af retinsyrerelateret forældreløs receptor (ROR) α (ROR-α)9 og GATA Binding Protein 3 (GATA-3)10,11,12 . Hos mus karakteriseres intestinale “inflammatoriske” ILC2’er yderligere ved ekspression af Killer cell lectin-lignende receptor (underfamilie G-medlem 1, KLRG)13, hvor de reagerer på epiteltuftcelle afledt IL-2514,15. Endelig er type-3 ILC’er, som omfatter lymfoide vævsinducerceller og hjælperlignende type-3 ILC’er (ILC3’er), afhængige af transkriptionsfaktoren ROR-γt16 og klynger sig i grupper, der udskiller enten Granulocyt Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF), IL-17 eller IL-22 som reaktion på lokale IL-1β- og IL-23-signaler17. Lymfoide vævsinducerceller klynger sig i Peyers patches og er afgørende for udviklingen af disse sekundære lymfoide organer under udvikling18, mens ILC3’er er den mest rigelige ILC-undertype i den voksne murine tyndtarm lamina propria. Et af de tidligste murine intestinale organoide co-kultursystemer med ILC3’er blev udnyttet til at drille virkningen af cytokinet IL-22 på signaltransducer og aktivator af transkription 3 (STAT-3) medieret leucinrig gentagelse indeholdende G-proteinkoblet receptor 5 (Lgr5) + intestinal stamcelleproliferation19, et stærkt eksempel på en regenerativ ILC-epitelinteraktion. ILC’er udviser aftryk-heterogenitet mellem organer20,21 og udviser plasticitet mellem delmængder som reaktion på polariserende cytokiner22. Hvad der driver disse vævsspecifikke aftryk og plasticitetsforskelle, og hvilken rolle de spiller i kroniske sygdomme som IBD23, forbliver spændende emner, der kan behandles ved hjælp af organoide co-kulturer.

Tarmorganoider har vist sig som en vellykket og pålidelig model til at studere tarmepitelet24,25. Disse genereres ved dyrkning af tarmepitel Lgr5+ stamceller eller hele isolerede krypter, som omfatter Paneth-celler som en endogen kilde til Wnt Family Member 3A (Wnt3a). Disse 3D-strukturer opretholdes enten i syntetiske hydrogeler26 eller i biomaterialer, der efterligner den basale lamina propria, for eksempel Termisk tværbinding basal ekstracellulær matrix (TBEM), og suppleres yderligere med vækstfaktorer, der efterligner den omgivende niche, især epitelvækstfaktor (EGF), knoglemorfogenetisk protein (BMP)-hæmmer Noggin og en Lgr5-ligand og Wnt-agonist R-Spondin127 . Under disse betingelser opretholder organoider epitel-apico-basal polaritet og rekapitulerer krypt-villi-strukturen i tarmepitelet med spirende stamcellekrypter, der terminalt differentierer sig til absorberende og sekretoriske celler i midten af organoidet, som derefter kaster ind i det indre pseudolumen ved anoikis28. Selvom tarmorganoider alene har været enormt fordelagtige som reduktionistiske modeller for epiteludvikling og dynamik isoleret29,30, har de et enormt fremtidigt potentiale for at forstå, hvordan denne adfærd reguleres, påvirkes eller endda forstyrres af immunrummet.

I den følgende protokol beskrives en metode til co-kultur mellem murine tyndtarmsorganoider og lamina propria afledte ILC1’er, som for nylig blev brugt til at identificere, hvordan denne population uventet reducerer intestinale signaturer af inflammation og i stedet bidrager til øget epitelproliferation via TGF-β i dette system8.

Protocol

Alle forsøg skal gennemføres i overensstemmelse med og i overensstemmelse med alle relevante lovgivningsmæssige og institutionelle retningslinjer for anvendelse af dyr. Etisk godkendelse af undersøgelsen beskrevet i den følgende artikel og video blev erhvervet i overensstemmelse med og i overensstemmelse med alle relevante lovgivningsmæssige og institutionelle retningslinjer for dyrebrug. Alle mus blev aflivet ved cervikal dislokation i henhold til den standard etiske procedure, udført …

Representative Results

Når det er afsluttet, skal friskisolerede krypter danne spirende kryptstrukturer inden for 2-4 dage (figur 1A). Sunde og robuste organoidkulturer bør vokse aktivt og kan passeres og udvides som beskrevet i protokollen. Denne protokol beskriver isoleringen af tyndtarm ILC1 fra RORγtGFP murine transgen reporterlinje, som tillader isolering af levende ILC1 af FACS (figur 2). Ved hjælp af den protokol, der er skitseret her,…

Discussion

Denne protokol beskriver metoderne til etablering af murine tyndtarmsorganoider, isolering af sjældne ILC1 ved at minimere tabet af lymfocytter under tarmsociationsprotokollen og etablere co-kulturer mellem disse to rum. Der er mange trin i denne protokol, og mens nogle er specifikke for ILC1’er, kan denne tilgang anvendes på andre intestinale immuncelletyper, og co-kulturopsætninger kan modulært tilpasses til individuelle forskningsspørgsmål. Flere kritiske trin (som anbefales ikke at afvige fra) samt fejlfindings…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

E.R. anerkender et ph.d.-stipendium fra Wellcome Trust (215027 / Z / 18 / Z). G.M.J. anerkender et ph.d.-stipendium fra Wellcome Trust (203757 / Z / 16 / A). DC anerkender en ph.d. studerende fra NIHR GSTT BRC. J.F.N. anerkender et Marie Skłodowska-Curie-stipendium, et King’s Prize-stipendium, et RCUK/UKRI Rutherford Fund-stipendium (MR/R024812/1) og en Seed Award in Science fra Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Vi takker også BRC flow cytometri kerneteamet baseret på Guy’s Hospital. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 reportermus var en generøs gave fra G. Eberl (Institut Pasteur, Paris, Frankrig). CD45.1 C57BL/6 mus blev venligst givet af T. Lawrence (King’s College London, London) og P. Barral (King’s College London, London).

Materials

Reagents
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
Anti-mouse CD45 (BV510) BioLegend 103137
Anti-mouse NK1.1 (PE) Thermo Fisher Scientific 12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0031-82
CHIR99021 Tocris 4423/10
COLLAGENASE D, 500MG Merck 11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) Merck 4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) Gibco 11320033
DNASE I, GRADE II Merck 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) Gibco 21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate Acid Thermo Fisher Scientific BP2482-100
FC block 2B Scientific BE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated Gibco 10500064
GlutaMAX (100X) Gibco 3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X) Gibco 14065056
HBSS (1X) Gibco 12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M) Gibco 15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) Thermo Fisher Scientific 46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Thermo Fisher Scientific L23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free Corning 356231
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048
N-acetylcysteine (500mM) Merck A9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) Thermo Fisher 25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pH Thermo Fisher Scientific 12549079
PBS (10X) Gibco 70013032
Percoll Cytiva 17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein R&D Systems AFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF R&D Systems 247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free) BioLegend 589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) R&D Systems 407-ML-005/CF
UltraComp eBeads Thermo Fisher Scientific 01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Bio-techne 1254
Plastics
50 mL tube Falcon 10788561
1.5 mL tube Eppendorf 30121023
10 mL pippette StarLab E4860-0010
15 mL tube Falcon 11507411
25 mL pippette StarLab E4860-0025
p10 pippette tips StarLab S1121-3810-C
p1000 pippette tips StarLab I1026-7810
p200 pippette tips StarLab E1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plate Falcon 353047
Equipment
Centrifuge Eppendorf 5810 R
CO2 and temperature controled incubator Eppendorf Galaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular Sorter BD equipment FACS Aria II
Heated shaker Stuart Equipment SI500
Ice box – –
Inverted light microscope Thermo Fisher Scientific EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippette Eppendorf 3124000016
p1000 pippette Eppendorf 3124000063
p200 pippette Eppendorf 3124000032
Pippette gun Eppendorf 4430000018
Wet ice – –
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).
  3. Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis. Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).
  4. Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
  5. Vivier, E., et al. Innate lymphoid cells: 10 years on. Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).
  6. Klose, C. S. N., et al. Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages. Cell. 157 (2), 340-356 (2014).
  7. Bernink, J. H., et al. Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria. Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).
  8. Jowett, G. M., et al. ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling. Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).
  9. Wong, S. H., et al. Transcription factor RORα is critical for nuocyte development. Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).
  10. Neill, D. R., et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity. Nature. 464, 1367-1370 (2010).
  11. Mjösberg, J., et al. The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).
  12. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  13. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential ‘inflammatory’ type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).
  14. von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529, 221-225 (2016).
  15. Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529, 226-230 (2016).
  16. Eberl, G., et al. An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells. Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).
  17. Spits, H., et al. Innate lymphoid cells–a proposal for uniform nomenclature. Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).
  18. Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells. Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).
  19. Lindemans, C. A., et al. Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration. Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).
  20. Meininger, I., et al. Tissue-specific features of innate lymphoid cells. Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).
  21. Dutton, E. E., et al. Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity. Wellcome Open Research. 2, 117 (2018).
  22. Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. Plasticity of innate lymphoid cell subsets. Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).
  23. Bernink, J. H., et al. Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues. Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
  26. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  27. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2012).
  28. Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).
  29. Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Biologia do Desenvolvimento. 420 (2), 262-270 (2016).
  30. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  31. Tallapragada, N. P., et al. Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids. Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).
  32. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281 (2018).
  33. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  34. O’Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
  35. Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).
  36. Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
  37. Cardoso, V., et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).
  38. Gury-BenAri, M., et al. The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome. Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).
  39. Seehus, C., Kaye, J. In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells. Bio-protocol. 6 (6), 1770 (2016).

Tags

Keywords: Co-cultureMurineSmall IntestineEpithelial OrganoidsInnate Lymphoid CellsIn Vitro ModelIntestinal HomeostasisInflammationILC1CD44Gastrointestinal DiseasesThermal Cross-linkingBasal Extracellular MatrixAdvanced DMEM F12PBS2Centrifugation
check_url/pt/63554?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Read, E., Jowett, G. M., Coman, D., Neves, J. F. Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells. J. Vis. Exp. (181), e63554, doi:10.3791/63554 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image