Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen
Summary
Dieses Protokoll bietet detaillierte Anweisungen zur Etablierung von murinen Dünndarmorganoiden, zur Isolierung angeborener Lymphzellen des Typs 1 aus der murinen Dünndarmlamina propria und zur Etablierung von 3-dimensionalen (3D) Kokulturen zwischen beiden Zelltypen, um bidirektionale Wechselwirkungen zwischen Darmepithelzellen und angeborenen lymphatischen Typ-1-Zellen zu untersuchen.
Abstract
Komplexe Co-Kulturen von Organoiden mit Immunzellen bieten ein vielseitiges Werkzeug, um die bidirektionalen Wechselwirkungen zu hinterfragen, die das empfindliche Gleichgewicht der Schleimhauthomöostase untermauern. Diese multizellulären 3D-Systeme bieten ein reduktionistisches Modell für die Behandlung multifaktorieller Erkrankungen und die Lösung technischer Schwierigkeiten, die bei der Untersuchung seltener Zelltypen wie geweberesidenten angeborenen lymphatischen Zellen (ILCs) auftreten. Dieser Artikel beschreibt ein murines System, das Dünndarmorganoide und von Dünndarmlamina propria abgeleitete helferähnliche Typ-1-ILCs (ILC1s) kombiniert, die leicht auf andere ILC- oder Immunpopulationen ausgedehnt werden können. ILCs sind eine gewebeansässige Population, die besonders in der Schleimhaut angereichert ist, wo sie die Homöostase fördern und schnell auf Schäden oder Infektionen reagieren. Organoide Co-Kulturen mit ILCs haben bereits begonnen, neue epitheliale Immunsignalmodule im Darm zu beleuchten und zu zeigen, wie verschiedene ILC-Untergruppen die Integrität und Regeneration der Darmepithelbarriere beeinflussen. Dieses Protokoll wird weitere Untersuchungen über reziproke Wechselwirkungen zwischen Epithel- und Immunzellen ermöglichen, die das Potenzial haben, neue Einblicke in die Mechanismen der Schleimhauthomöostase und -entzündung zu liefern.
Introduction
Die Kommunikation zwischen dem Darmepithel und dem darmresidenten Immunsystem ist für die Aufrechterhaltung der Darmhomöostase von zentraler Bedeutung1. Störungen dieser Wechselwirkungen sind sowohl mit lokalen als auch mit systemischen Erkrankungen verbunden, einschließlich entzündlicher Darmerkrankungen (IBD) und Magen-Darm-Krebs2. Ein bemerkenswertes Beispiel für einen kürzlich beschriebenen kritischen Regulator der Homöostase stammt aus der Untersuchung angeborener lymphatischer Zellen (ILCs), die sich als Schlüsselfiguren in der intestinalen Immunlandschaftherauskristallisiert haben 3. ILCs sind eine Gruppe heterogener angeborener Immunzellen, die die intestinale Homöostase regulieren und Entzündungen weitgehend durch Zytokin-vermittelte Signalgebung orchestrieren4.
Murine ILCs sind grob in Subtypen unterteilt, basierend auf Transkriptionsfaktor-, Rezeptor- und Zytokinexpressionsprofilen5. Typ-1-ILCs, zu denen zytotoxische Natural Killer (NK)-Zellen und helferähnliche Typ-1-ILCs (ILC1s) gehören, werden durch die Expression des Transkriptionsfaktors (Eomesodermin) Eomes und T-Box-Proteins, die in T-Zellen (T-bet)6 exprimiert werden, sowie Sekretionszytokine, die mit T-Helfer-Typ-1 (TH1) assoziiert sind, definiert: Interferon-γ (IFNγ) und Tumornekrosefaktor (TNF) als Reaktion auf Interleukin (IL)-12, IL-15 und IL-187. Während der Homöostase sezernieren geweberesidente ILC1s den transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β), um die Epithelproliferation und den Matrixumbauvoranzutreiben 8. Typ-2-ILCs (ILC2s) reagieren in erster Linie auf eine Helmintheninfektion über die Sekretion von T-Helfer-Typ-2 (TH2)-assoziierten Zytokinen: IL-4, IL-5 und IL-13, und sind durch die Expression von Retinsäure-assoziierten Orphan-Rezeptoren (ROR) α (ROR-α)9 und GATA Binding Protein 3 (GATA-3)10,11,12 gekennzeichnet. . Bei Mäusen sind intestinale “entzündliche” ILC2s weiter durch die Expression des Killerzell-lektinähnlichen Rezeptors (Unterfamilie G Member 1, KLRG)13 gekennzeichnet, wo sie auf epitheliale Büschelzell-abgeleitete IL-2514,15 reagieren. Schließlich sind Typ-3-ILCs, zu denen lymphatische Gewebeinduktorzellen und helferähnliche Typ-3-ILCs (ILC3s) gehören, vom Transkriptionsfaktor ROR-γt16 abhängig und gruppieren sich in Gruppen, die entweder Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulierungsfaktor (GM-CSF), IL-17 oder IL-22 als Reaktion auf lokale IL-1β- und IL-23-Signale17 absondern. Lymphoide Gewebeinduktorzellen gruppieren sich in Peyer-Pflastern und sind entscheidend für die Entwicklung dieser sekundären lymphatischen Organe während der Entwicklung18, während ILC3s der am häufigsten vorkommende ILC-Subtyp im erwachsenen murinen Dünndarmlamina propria sind. Eines der frühesten murinen Darm-Organoid-Co-Kultursysteme mit ILC3s wurde genutzt, um den Einfluss des Zytokins IL-22 auf den Signalwandler und den Aktivator der Transkription 3 (STAT-3) zu zerlegen, der den Leucin-Rich Repeat Containing G Protein Coupled Receptor 5 (Lgr5) + die Proliferation von Darmstammzellen19 vermittelt, ein starkes Beispiel für eine regenerative ILC-Epithel-Interaktion. ILCs zeigen eine Abdruck-Heterogenität zwischen den Organen 20,21 und eine Plastizität zwischen Teilmengen als Reaktion auf polarisierende Zytokine22. Was diese gewebespezifischen Abdrücke und Plastizitätsunterschiede antreibt und welche Rolle sie bei chronischen Erkrankungen wie IBD23 spielen, bleiben spannende Themen, die mit organoiden Co-Kulturen adressiert werden könnten.
Darmorganoide haben sich als erfolgreiches und zuverlässiges Modell zur Untersuchung des Darmepithels24,25 herausgestellt. Diese werden durch Kultivierung von intestinalen epithelialen Lgr5+-Stammzellen oder ganzen isolierten Krypten erzeugt, zu denen Paneth-Zellen als endogene Quelle des Wnt-Familienmitglieds 3A (Wnt3a) gehören. Diese 3D-Strukturen werden entweder in synthetischen Hydrogelen26 oder in Biomaterialien beibehalten, die die basale lamina propria nachahmen, zum Beispiel der Thermal-Crosslinking Basal Extracellular Matrix (TBEM), und werden durch Wachstumsfaktoren ergänzt, die die umgebende Nische nachahmen, insbesondere Epithelial Growth Factor (EGF), der Bone Morphogenetic Protein (BMP)-Inhibitor Noggin und ein Lgr5-Ligander und Wnt-Agonist R-Spondin127 . Unter diesen Bedingungen halten Organoide die epitheliale apiko-basale Polarität aufrecht und rekapitulieren die Krypta-Zotten-Struktur des Darmepithels mit knospenden Stammzellkrypten, die sich im Zentrum des Organoids endgültig in absorbierende und sekretorische Zellen differenzieren, die dann durch Anoikis28 in das innere Pseudolumen abgeworfen werden. Obwohl Darmorganoide allein als reduktionistische Modelle der Epithelentwicklung und -dynamik in Isolation von großem Vorteil waren29,30, bergen sie ein enormes zukünftiges Potenzial, um zu verstehen, wie diese Verhaltensweisen vom Immunkompartiment reguliert, beeinflusst oder sogar gestört werden.
Im folgenden Protokoll wird eine Methode der Kokultur zwischen murinen Dünndarmorganoiden und von Lamina propria abgeleiteten ILC1s beschrieben, die kürzlich verwendet wurde, um zu identifizieren, wie diese Population unerwartet die Darmsignaturen von Entzündungen verringert und stattdessen zu einer erhöhten Epithelproliferation über TGF-β in diesem System beiträgt8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Methoden zur Etablierung von murinen Dünndarmorganoiden, zur Isolierung seltener ILC1 durch Minimierung des Verlusts von Lymphozyten während des intestinalen Dissoziationsprotokolls und zur Etablierung von Kokulturen zwischen diesen beiden Kompartimenten. Es gibt viele Schritte zu diesem Protokoll, und während einige spezifisch für ILC1s sind, kann dieser Ansatz auf andere intestinale Immunzelltypen angewendet werden, und Co-Kultur-Setups können modular an individuelle Forschungsfrage…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.R. bestätigt ein Ph.D. Stipendium des Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). G.M.J. würdigt ein Ph.D. Stipendium des Wellcome Trust (203757/Z/16/A). D.C. erkennt eine Doktorandenschaft von der NIHR GSTT BRC an. J.F.N. würdigt ein Marie-Skłodowska-Curie-Stipendium, ein King’s Prize-Stipendium, ein RCUK/UKRI Rutherford Fund-Stipendium (MR/R024812/1) und einen Seed Award in Science vom Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Wir danken auch dem BRC-Durchflusszytometrie-Kernteam am Guy’s Hospital. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 Reportermäuse waren ein großzügiges Geschenk von G. Eberl (Institut Pasteur, Paris, Frankreich). CD45.1 C57BL/6 Mäuse wurden freundlicherweise von T. Lawrence (King’s College London, London) und P. Barral (King’s College London, London) gegeben.
Materials
| Reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-mouse CD45 (BV510) | BioLegend | 103137 | |
| Anti-mouse NK1.1 (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-5941-83 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| CD127 Monoclonal Antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-1271-82 | |
| CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0193-82 | |
| CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0051-82 | |
| CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0031-82 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423/10 | |
| COLLAGENASE D, 500MG | Merck | 11088866001 | |
| Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells | Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University) | ||
| DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) | Merck | 4942078001 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) | Gibco | 11320033 | |
| DNASE I, GRADE II | Merck | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) | Gibco | 21969-035 | |
| Ethilenediamine Tetraacetate Acid | Thermo Fisher Scientific | BP2482-100 | |
| FC block | 2B Scientific | BE0307 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated | Gibco | 10500064 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 3050-038 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14065056 | |
| HBSS (1X) | Gibco | 12549069 | |
| HEK-293T- mNoggin-Fc Cells | Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012). | ||
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) | Thermo Fisher Scientific | 46-5893-82 | |
| Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Thermo Fisher Scientific | L23105 | |
| Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-5931-82 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetylcysteine (500mM) | Merck | A9165 | |
| NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) | Thermo Fisher | 25-3351-82 | |
| PBS (1 X) 7.2 pH | Thermo Fisher Scientific | 12549079 | |
| PBS (10X) | Gibco | 70013032 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | |
| Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein | R&D Systems | AFL236 | |
| Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF | R&D Systems | 247-GMP | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier free) | BioLegend | 589106 | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) | R&D Systems | 407-ML-005/CF | |
| UltraComp eBeads | Thermo Fisher Scientific | 01-2222-42 | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Bio-techne | 1254 | |
| Plastics | |||
| 50 mL tube | Falcon | 10788561 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 30121023 | |
| 10 mL pippette | StarLab | E4860-0010 | |
| 15 mL tube | Falcon | 11507411 | |
| 25 mL pippette | StarLab | E4860-0025 | |
| p10 pippette tips | StarLab | S1121-3810-C | |
| p1000 pippette tips | StarLab | I1026-7810 | |
| p200 pippette tips | StarLab | E1011-0921 | |
| Standard tissue culture treated 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| CO2 and temperature controled incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R/S | |
| Flow Assisted Cellular Sorter | BD equipment | FACS Aria II | |
| Heated shaker | Stuart Equipment | SI500 | |
| Ice box | – | – | |
| Inverted light microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000) | |
| p10 pippette | Eppendorf | 3124000016 | |
| p1000 pippette | Eppendorf | 3124000063 | |
| p200 pippette | Eppendorf | 3124000032 | |
| Pippette gun | Eppendorf | 4430000018 | |
| Wet ice | – | – |
Referências
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