Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate
Summary
Questo protocollo offre istruzioni dettagliate per stabilire organoidi murini dell’intestino tenue, isolare le cellule linfoidi innate di tipo 1 dalla lamina propria dell’intestino tenue murino e stabilire co-colture tridimensionali (3D) tra entrambi i tipi di cellule per studiare le interazioni bidirezionali tra le cellule epiteliali intestinali e le cellule linfoidi innate di tipo 1.
Abstract
Complesse co-colture di organoidi con cellule immunitarie forniscono uno strumento versatile per interrogare le interazioni bidirezionali che sono alla base del delicato equilibrio dell’omeostasi della mucosa. Questi sistemi 3D e multicellulari offrono un modello riduzionista per affrontare le malattie multifattoriali e risolvere le difficoltà tecniche che sorgono quando si studiano tipi di cellule rare come le cellule linfoidi innate residenti nei tessuti (ILC). Questo articolo descrive un sistema murino che combina organoidi dell’intestino tenue e ILC di tipo 1 (ILC1) derivati dalla lamina propria dell’intestino tenue, che possono essere facilmente estesi ad altre POPOLAZIONI ILC o immunitarie. Le ILC sono una popolazione residente nei tessuti particolarmente arricchita nella mucosa, dove promuovono l’omeostasi e rispondono rapidamente a danni o infezioni. Le co-colture organoidi con ILC hanno già iniziato a far luce su nuovi moduli di segnalazione epiteliale-immunitaria nell’intestino, rivelando come diversi sottoinsiemi di ILC influiscono sull’integrità e sulla rigenerazione della barriera epiteliale intestinale. Questo protocollo consentirà ulteriori indagini sulle interazioni reciproche tra cellule epiteliali e immunitarie, che hanno il potenziale per fornire nuove informazioni sui meccanismi dell’omeostasi e dell’infiammazione della mucosa.
Introduction
La comunicazione tra l’epitelio intestinale e il sistema immunitario residente nell’intestino è fondamentale per il mantenimento dell’omeostasi intestinale1. Le interruzioni di queste interazioni sono associate a malattie sia locali che sistemiche, tra cui la malattia infiammatoria intestinale (IBD) e i tumori gastrointestinali2. Un esempio notevole di un regolatore critico dell’omeostasi descritto più di recente proviene dallo studio delle cellule linfoidi innate (ILC), che sono emerse come attori chiave nel panorama immunitario intestinale3. Le ILC sono un gruppo di cellule immunitarie innate eterogenee che regolano l’omeostasi intestinale e orchestrano l’infiammazione in gran parte attraverso la segnalazione mediata da citochine4.
Le ILC murine sono ampiamente suddivise in sottotipi basati sul fattore di trascrizione, sul recettore e sui profili di espressione delle citochine5. Le ILC di tipo 1, che includono cellule natural killer citotossiche (NK) e ILC di tipo 1 simili a helper (ILC1), sono definite dall’espressione del fattore di trascrizione (eomesodermi) Eomes e della proteina T-box espresse rispettivamente nelle cellule T (T-bet)6 e secernono citochine associate all’immunità T helper di tipo 1 (TH H1): interferone-γ (IFNγ) e fattore di necrosi tumorale (TNF), in risposta all’interleuchina (IL)-12, IL-15 e IL-187. Durante l’omeostasi, gli ILC1 residenti nei tessuti secernono β del fattore di crescita trasformante (TGF-β) per guidare la proliferazione epiteliale e il rimodellamento della matrice8. Le ILC di tipo 2 (ILC2) rispondono principalmente all’infezione da elminti attraverso la secrezione di citochine associate a T helper di tipo 2 (TH2): IL-4, IL-5 e IL-13 e sono caratterizzate dall’espressione del recettore orfano correlato all’acido retinoico (ROR) α (ROR-α)9 e della proteina legante GATA 3 (GATA-3)10,11,12 . Nei topi, gli ILC2 “infiammatori” intestinali sono ulteriormente caratterizzati dall’espressione del recettore simile alla lectina delle cellule killer (sottofamiglia G membro 1, KLRG)13 dove rispondono a IL-2514,15 derivato dalle cellule del ciuffo epiteliali. Infine, le ILC di tipo 3, che includono cellule indurici del tessuto linfoide e ILC di tipo 3 simili a helper (ILC3), dipendono dal fattore di trascrizione ROR-γt16 e si raggruppano in gruppi che secernono il fattore stimolante la colonia di macrofagi dei granulociti (GM-CSF), IL-17 o IL-22 in risposta ai segnali locali IL-1β e IL-2317. Le cellule indurici del tessuto linfoide si raggruppano nei cerotti di Peyer e sono cruciali per lo sviluppo di questi organi linfoidi secondari durante lo sviluppo18, mentre gli ILC3 sono il sottotipo ILC più abbondante nella lamina propria dell’intestino tenue murino adulto. Uno dei primi sistemi di co-coltura di organoidi intestinali murini con ILC3 è stato sfruttato per separare l’impatto della citochina IL-22 sul trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3 (STAT-3) mediato dalla ripetizione ricca di leucina contenente il recettore accoppiato alla proteina G 5 (Lgr5) + proliferazione delle cellule staminali intestinali19, un potente esempio di interazione rigenerativa ILC-epiteliale. Le ILC mostrano eterogeneità di impronta tra gli organi20,21 e mostrano plasticità tra i sottoinsiemi in risposta alle citochine polarizzanti22. Ciò che guida queste impronte tessuto-specifiche e le differenze di plasticità, e quale ruolo svolgono in malattie croniche come IBD23, rimangono argomenti interessanti che potrebbero essere affrontati utilizzando co-colture organoidiche.
Gli organoidi intestinali sono emersi come un modello di successo e affidabile per studiare l’epitelio intestinale24,25. Questi sono generati dalla coltivazione di cellule staminali Lgr5+ epiteliali intestinali, o intere cripte isolate, che includono le cellule di Paneth come fonte endogena del membro della famiglia Wnt 3A (Wnt3a). Queste strutture 3D sono mantenute in idrogel sintetici26 o in biomateriali che imitano la lamina propria basale, ad esempio la matrice extracellulare basale reticolante termica (TBEM), e sono ulteriormente integrate con fattori di crescita che imitano la nicchia circostante, in particolare il fattore di crescita epiteliale (EGF), l’inibitore della proteina morfogenetica ossea (BMP) Noggin e un Lgr5-ligando e Wnt-agonista R-Spondin127 . In queste condizioni, gli organoidi mantengono la polarità apico-basale epiteliale e ricapitolano la struttura cripto-villi dell’epitelio intestinale con cripte di cellule staminali in erba che si differenziano terminalmente in cellule assorbenti e secretorie al centro dell’organoide, che poi si riversano nello pseudolume interno da anoikis28. Sebbene gli organoidi intestinali da soli siano stati estremamente vantaggiosi come modelli riduzionisti di sviluppo e dinamica epiteliale in isolamento29,30, hanno un enorme potenziale futuro per capire come questi comportamenti sono regolati, influenzati o addirittura interrotti dal compartimento immunitario.
Nel seguente protocollo, viene descritto un metodo di co-coltura tra organoidi intestinali piccoli murini e ILC1 derivati dalla lamina propria, che è stato recentemente utilizzato per identificare come questa popolazione diminuisce inaspettatamente le firme intestinali dell’infiammazione e contribuisce invece ad aumentare la proliferazione epiteliale tramite TGF-β in questo sistema8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive i metodi per stabilire organoidi murini dell’intestino tenue, isolando il raro ILC1 riducendo al minimo la perdita di linfociti durante il protocollo di dissociazione intestinale e stabilendo co-colture tra questi due compartimenti. Ci sono molti passaggi per questo protocollo, e mentre alcuni sono specifici per ILC1, questo approccio può essere applicato ad altri tipi di cellule immunitarie intestinali e le configurazioni di co-coltura possono essere adattate in modo modulare per soddisfare l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.R. riconosce una borsa di dottorato dal Wellcome Trust (215027 / Z / 18 / Z). G.M.J. riconosce una borsa di dottorato dal Wellcome Trust (203757 / Z / 16 / A). D.C. riconosce un dottorato di ricerca. studentship dal NIHR GSTT BRC. J.F.N. riconosce una borsa di studio Marie Skłodowska-Curie, una borsa di studio King’s Prize, una borsa di studio RCUK / UKRI Rutherford Fund (MR / R024812 / 1) e un Seed Award in Science dal Wellcome Trust (204394 / Z / 16 / Z). Ringraziamo anche il team principale della citometria a flusso BRC con sede presso il Guy’s Hospital. I topi reporter Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 sono stati un generoso dono di G. Eberl (Institut Pasteur, Parigi, Francia). I topi CD45.1 C57BL/6 sono stati gentilmente somministrati da T. Lawrence (King’s College London, Londra) e P. Barral (King’s College London, Londra).
Materials
| Reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-mouse CD45 (BV510) | BioLegend | 103137 | |
| Anti-mouse NK1.1 (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-5941-83 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| CD127 Monoclonal Antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-1271-82 | |
| CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0193-82 | |
| CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0051-82 | |
| CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0031-82 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423/10 | |
| COLLAGENASE D, 500MG | Merck | 11088866001 | |
| Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells | Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University) | ||
| DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) | Merck | 4942078001 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) | Gibco | 11320033 | |
| DNASE I, GRADE II | Merck | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) | Gibco | 21969-035 | |
| Ethilenediamine Tetraacetate Acid | Thermo Fisher Scientific | BP2482-100 | |
| FC block | 2B Scientific | BE0307 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated | Gibco | 10500064 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 3050-038 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14065056 | |
| HBSS (1X) | Gibco | 12549069 | |
| HEK-293T- mNoggin-Fc Cells | Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012). | ||
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) | Thermo Fisher Scientific | 46-5893-82 | |
| Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Thermo Fisher Scientific | L23105 | |
| Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-5931-82 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetylcysteine (500mM) | Merck | A9165 | |
| NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) | Thermo Fisher | 25-3351-82 | |
| PBS (1 X) 7.2 pH | Thermo Fisher Scientific | 12549079 | |
| PBS (10X) | Gibco | 70013032 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | |
| Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein | R&D Systems | AFL236 | |
| Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF | R&D Systems | 247-GMP | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier free) | BioLegend | 589106 | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) | R&D Systems | 407-ML-005/CF | |
| UltraComp eBeads | Thermo Fisher Scientific | 01-2222-42 | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Bio-techne | 1254 | |
| Plastics | |||
| 50 mL tube | Falcon | 10788561 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 30121023 | |
| 10 mL pippette | StarLab | E4860-0010 | |
| 15 mL tube | Falcon | 11507411 | |
| 25 mL pippette | StarLab | E4860-0025 | |
| p10 pippette tips | StarLab | S1121-3810-C | |
| p1000 pippette tips | StarLab | I1026-7810 | |
| p200 pippette tips | StarLab | E1011-0921 | |
| Standard tissue culture treated 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| CO2 and temperature controled incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R/S | |
| Flow Assisted Cellular Sorter | BD equipment | FACS Aria II | |
| Heated shaker | Stuart Equipment | SI500 | |
| Ice box | – | – | |
| Inverted light microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000) | |
| p10 pippette | Eppendorf | 3124000016 | |
| p1000 pippette | Eppendorf | 3124000063 | |
| p200 pippette | Eppendorf | 3124000032 | |
| Pippette gun | Eppendorf | 4430000018 | |
| Wet ice | – | – |
Referências
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