Co-kultur av murine tynntarmen epitelial organoider med medfødte lymfoide celler
Summary
Denne protokollen gir detaljerte instruksjoner for å etablere murine tynntarmen organoider, isolere type-1 medfødte lymfoidceller fra murine tynntarmen lamina propria, og etablere 3-dimensjonale (3D) kokulturer mellom begge celletyper for å studere toveis interaksjoner mellom intestinale epitelceller og type-1 medfødte lymfoidceller.
Abstract
Komplekse kokulturer av organoider med immunceller gir et allsidig verktøy for å forhøre de toveis interaksjonene som underbygger den delikate balansen mellom mucosal homeostase. Disse 3D-, multicellulære systemene tilbyr en reduksjonistisk modell for å håndtere flerfaktorielle sykdommer og løse tekniske vanskeligheter som oppstår når man studerer sjeldne celletyper som vevsboende medfødte lymfoidceller (ILCer). Denne artikkelen beskriver et murinsystem som kombinerer tynntarmen organoider og tynntarmen lamina propria avledet helper-lignende type-1 ILCs (ILC1s), som lett kan utvides til andre ILC eller immunpopulasjoner. ILCer er en vevsbeboende befolkning som er spesielt beriket i slimhinnen, hvor de fremmer homeostase og raskt reagerer på skade eller infeksjon. Organoide samkulturer med ILCer har allerede begynt å kaste lys over nye epitel-immunsignalmoduler i tarmen, og avslører hvordan forskjellige ILC-undergrupper påvirker intestinal epitelial barriereintegritet og regenerering. Denne protokollen vil muliggjøre ytterligere undersøkelser av gjensidige interaksjoner mellom epitelceller og immunceller, som har potensial til å gi ny innsikt i mekanismene for mucosal homeostase og betennelse.
Introduction
Kommunikasjon mellom tarmepitelet og tarmboende immunsystem er sentralt for vedlikehold av intestinal homeostase1. Forstyrrelser i disse interaksjonene er forbundet med både lokale og systemiske sykdommer, inkludert inflammatorisk tarmsykdom (IBD) og gastrointestinal kreft2. Et bemerkelsesverdig eksempel på en nylig beskrevet kritisk regulator av homeostase kommer fra studiet av medfødte lymfoide celler (ILCer), som har dukket opp som nøkkelspillere i tarmimmunitetslandskapet3. ILCer er en gruppe heterogene medfødte immunceller som regulerer intestinal homeostase og orkestrerer betennelse i stor grad gjennom cytokinmediert signal4.
Murine ILCer er bredt delt inn i undertyper basert på transkripsjonsfaktor, reseptor og cytokinuttrykksprofiler5. Type-1 ILCer, som inkluderer cytotoksiske natural killer (NK)-celler og hjelperlignende type-1 ILCer (ILC1s), defineres ved uttrykk for transkripsjonsfaktoren (eomesodermin) Eomes og T-box protein uttrykt i T-celler (T-bet)6, henholdsvis, og utskille cytokiner assosiert med T-hjelper type-1 (TH1) immunitet: interferon-γ (IFNγ) og tumornekrosefaktor (TNF), som svar på interleukin (IL)-12, IL-15 og IL-187. Under homeostase utskiller vevsboende ILC1s Transforming Growth Factor β (TGF-β) for å drive epitelproliferasjon og matrise ombygging8. Type-2 ILCer (ILC2s) reagerer primært på helminthinfeksjon via sekresjon av T-hjelper type 2 (TH2) assosierte cytokiner: IL-4, IL-5, og IL-13, og er preget av uttrykk for retinoinsyrerelatert foreldreløs reseptor (ROR) α (ROR-α)9 og GATA Binding Protein 3 (GATA-3)10,11,12 . Hos mus er intestinale “inflammatoriske” ILC2s ytterligere preget av uttrykk for Killer celle lectin-lignende reseptor (underfamilie G medlem 1, KLRG)13 hvor de reagerer på epitelial tuft-celle avledet IL-2514,15. Til slutt skriver du inn-3 ILCer, som inkluderer lymfoide vevs induserceller og hjelperlignende type-3 ILCer (ILC3s), er avhengige av transkripsjonsfaktoren ROR-γt16, og klynger seg inn i grupper som skiller ut enten Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF), IL-17 eller IL-22 som svar på lokale IL-1β og IL-23 signaler17. Lymfoide vevsinduserceller klynger seg i Peyers flekker og er avgjørende for utviklingen av disse sekundære lymfoide organene under utvikling18, mens ILC3s er den mest tallrike ILC-subtypen i den voksne murine tynntarmen lamina propria. Et av de tidligste murin intestinale organoid-kokultursystemene med ILC3s ble utnyttet til å erte fra hverandre virkningen av cytokin IL-22 på signaltransduser og aktivator av transkripsjon 3 (STAT-3) mediert Leucine-Rich Repeat som inneholder G Protein Coupled Receptor 5 (Lgr5)+ intestinal stamcelleproliferasjon19, et kraftig eksempel på en regenerativ ILC-epitelinteraksjon. ILCer viser avtrykk-heterogenitet mellom organer 20,21 og utviser plastisitet mellom delsett som svar på polariserende cytokiner22. Hva som driver disse vevsspesifikke avtrykkene og plastisitetsforskjellene, og hvilken rolle de spiller i kroniske sykdommer som IBD23, forblir spennende emner som kan tas opp ved hjelp av organoide samkulturer.
Intestinale organoider har dukket opp som en vellykket og pålitelig modell for å studere tarmepitelet 24,25. Disse genereres ved å dyrke intestinale epiteliale Lgr5+ stamceller, eller hele isolerte krypter, som inkluderer Paneth-celler som en endogene kilde til Wnt Family Member 3A (Wnt3a). Disse 3D-strukturene opprettholdes enten i syntetiske hydrogeler26 eller i biomaterialer som etterligner basal lamina propria, for eksempel Termisk-krysskobling Basal Extracellular Matrix (TBEM), og er ytterligere supplert med vekstfaktorer som etterligner den omkringliggende nisjen, spesielt Epithelial Growth Factor (EGF), Bone Morphogenetic Protein (BMP)-inhibitor Noggin, og en Lgr5-ligand og Wnt-agonist R-Spondin127 . Under disse forholdene opprettholder organoider epitelial apico-basal polaritet og rekapitulerer krypt-villi-strukturen i tarmepitelet med spirende stamcellekrypter som terminalt skiller seg ut i absorptive og sekretoriske celler i midten av organoiden, som deretter kaster inn i den indre pseudolumen av anoikis28. Selv om intestinale organoider alene har vært enormt fordelaktige som reduksjonistiske modeller for epitelutvikling og dynamikk isolertsett 29,30, har de et enormt fremtidig potensial for å forstå hvordan disse atferdene reguleres, påvirkes eller til og med forstyrres av immunrommet.
I følgende protokoll beskrives en metode for samkultur mellom murin små intestinale organoider og lamina propria avledet ILC1s, som nylig ble brukt til å identifisere hvordan denne befolkningen uventet reduserer tarmsignaturer av betennelse og i stedet bidrar til økt epitelial spredning via TGF-β i dette systemet8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver metodene for å etablere murin tynntarmen organoider, isolere sjeldne ILC1 ved å minimere tap av lymfocytter under tarmdissosiasjonsprotokollen, og etablere samkulturer mellom disse to rommene. Det er mange trinn i denne protokollen, og selv om noen er spesifikke for ILC1s, kan denne tilnærmingen brukes på andre tarmimmuncelletyper, og samkulturoppsett kan tilpasses modulært for å passe individuelle forskningsspørsmål. Flere kritiske trinn (som anbefales å ikke avvike fra), samt retnin…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.R. anerkjenner et ph.d.-stipendiat fra Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). G.M.J. anerkjenner et ph.d.-stipend fra Wellcome Trust (203757/Z/16/A). D.C. anerkjenner et ph.d.-studentstipend fra NIHR GSTT BRC. J.F.N. anerkjenner et Marie Skłodowska-Curie Fellowship, et king’s Prize fellowship, et RCUK/UKRI Rutherford Fund fellowship (MR/R024812/1), og en Seed Award in Science fra Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Vi takker også BRC flow cytometry core team basert på Guy’s Hospital. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 reportermus var en sjenerøs gave fra G. Eberl (Institut Pasteur, Paris, Frankrike). CD45.1 C57BL/6 mus ble vennlig gitt av T. Lawrence (King’s College London, London) og P. Barral (King’s College London, London).
Materials
| Reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-mouse CD45 (BV510) | BioLegend | 103137 | |
| Anti-mouse NK1.1 (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-5941-83 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| CD127 Monoclonal Antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-1271-82 | |
| CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0193-82 | |
| CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0051-82 | |
| CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0031-82 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423/10 | |
| COLLAGENASE D, 500MG | Merck | 11088866001 | |
| Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells | Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University) | ||
| DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) | Merck | 4942078001 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) | Gibco | 11320033 | |
| DNASE I, GRADE II | Merck | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) | Gibco | 21969-035 | |
| Ethilenediamine Tetraacetate Acid | Thermo Fisher Scientific | BP2482-100 | |
| FC block | 2B Scientific | BE0307 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated | Gibco | 10500064 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 3050-038 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14065056 | |
| HBSS (1X) | Gibco | 12549069 | |
| HEK-293T- mNoggin-Fc Cells | Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012). | ||
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) | Thermo Fisher Scientific | 46-5893-82 | |
| Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Thermo Fisher Scientific | L23105 | |
| Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-5931-82 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetylcysteine (500mM) | Merck | A9165 | |
| NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) | Thermo Fisher | 25-3351-82 | |
| PBS (1 X) 7.2 pH | Thermo Fisher Scientific | 12549079 | |
| PBS (10X) | Gibco | 70013032 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | |
| Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein | R&D Systems | AFL236 | |
| Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF | R&D Systems | 247-GMP | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier free) | BioLegend | 589106 | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) | R&D Systems | 407-ML-005/CF | |
| UltraComp eBeads | Thermo Fisher Scientific | 01-2222-42 | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Bio-techne | 1254 | |
| Plastics | |||
| 50 mL tube | Falcon | 10788561 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 30121023 | |
| 10 mL pippette | StarLab | E4860-0010 | |
| 15 mL tube | Falcon | 11507411 | |
| 25 mL pippette | StarLab | E4860-0025 | |
| p10 pippette tips | StarLab | S1121-3810-C | |
| p1000 pippette tips | StarLab | I1026-7810 | |
| p200 pippette tips | StarLab | E1011-0921 | |
| Standard tissue culture treated 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| CO2 and temperature controled incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R/S | |
| Flow Assisted Cellular Sorter | BD equipment | FACS Aria II | |
| Heated shaker | Stuart Equipment | SI500 | |
| Ice box | – | – | |
| Inverted light microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000) | |
| p10 pippette | Eppendorf | 3124000016 | |
| p1000 pippette | Eppendorf | 3124000063 | |
| p200 pippette | Eppendorf | 3124000032 | |
| Pippette gun | Eppendorf | 4430000018 | |
| Wet ice | – | – |
Referências
- Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).
- Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis. Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).
- Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
- Vivier, E., et al. Innate lymphoid cells: 10 years on. Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).
- Klose, C. S. N., et al. Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages. Cell. 157 (2), 340-356 (2014).
- Bernink, J. H., et al. Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria. Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).
- Jowett, G. M., et al. ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling. Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).
- Wong, S. H., et al. Transcription factor RORα is critical for nuocyte development. Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).
- Neill, D. R., et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity. Nature. 464, 1367-1370 (2010).
- Mjösberg, J., et al. The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential ‘inflammatory’ type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529, 221-225 (2016).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529, 226-230 (2016).
- Eberl, G., et al. An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells. Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells–a proposal for uniform nomenclature. Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).
- Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells. Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).
- Lindemans, C. A., et al. Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration. Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).
- Meininger, I., et al. Tissue-specific features of innate lymphoid cells. Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).
- Dutton, E. E., et al. Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity. Wellcome Open Research. 2, 117 (2018).
- Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. Plasticity of innate lymphoid cell subsets. Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).
- Bernink, J. H., et al. Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues. Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2012).
- Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).
- Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Biologia do Desenvolvimento. 420 (2), 262-270 (2016).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Tallapragada, N. P., et al. Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids. Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281 (2018).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- O’Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
- Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Cardoso, V., et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).
- Gury-BenAri, M., et al. The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome. Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).
- Seehus, C., Kaye, J. In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells. Bio-protocol. 6 (6), 1770 (2016).
