Кокультура эпителиальных органоидов тонкой кишки мышей с врожденными лимфоидными клетками
Summary
Этот протокол предлагает подробные инструкции по созданию органоидов тонкой кишки мышей, выделению врожденных лимфоидных клеток типа 1 из мышиной тонкой кишки lamina propria и созданию 3-мерных (3D) кокультур между обоими типами клеток для изучения двунаправленных взаимодействий между эпителиальными клетками кишечника и врожденными лимфоидными клетками типа 1.
Abstract
Сложные кокультуры органоидов с иммунными клетками обеспечивают универсальный инструмент для опроса о двунаправленных взаимодействиях, которые лежат в основе тонкого баланса гомеостаза слизистой оболочки. Эти 3D, многоклеточные системы предлагают редукционистскую модель для решения многофакторных заболеваний и разрешения технических трудностей, возникающих при изучении редких типов клеток, таких как ткане-резидентные врожденные лимфоидные клетки (ILC). В этой статье описывается мышиная система, которая сочетает в себе органоиды тонкой кишки и lamina propria тонкой кишки, полученные из хелпероподобных ILC типа 1 (ILC1), которые могут быть легко распространены на другие ILC или иммунные популяции. ILC – это популяция, проживающая в тканях, которая особенно обогащена слизистой оболочкой, где они способствуют гомеостазу и быстро реагируют на повреждение или инфекцию. Органоидные кокультуры с ILC уже начали проливать свет на новые эпителиально-иммунные сигнальные модули в кишечнике, показывая, как различные подмножества ILC влияют на целостность и регенерацию кишечного эпителиального барьера. Этот протокол позволит продолжить исследования взаимных взаимодействий между эпителиальными и иммунными клетками, которые могут обеспечить новое понимание механизмов гомеостаза слизистой оболочки и воспаления.
Introduction
Связь между кишечным эпителием и кишечно-резидентной иммунной системой занимает центральное место в поддержании кишечного гомеостаза1. Нарушения этих взаимодействий связаны как с местными, так и с системными заболеваниями, включая воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) и рак желудочно-кишечного тракта2. Примечательным примером одного недавно описанного критического регулятора гомеостаза является исследование врожденных лимфоидных клеток (ILC), которые стали ключевыми игроками в кишечном иммунном ландшафте3. ILC представляют собой группу гетерогенных врожденных иммунных клеток, которые регулируют гомеостаз кишечника и организуют воспаление в основном через цитокин-опосредованную сигнализацию4.
Мышиные ILC широко делятся на подтипы на основе транскрипционного фактора, рецептора и профилей экспрессии цитокинов5. ILC типа-1, которые включают цитотоксические естественные киллерные (NK) клетки и хелпероподобные ILC типа 1 (ILC1s), определяются экспрессией транскрипционного фактора (эомезодермина) Эомса и белка Т-бокса, экспрессируемого в Т-клетках (T-bet)6, соответственно, и секретируют цитокины, связанные с иммунитетом Т-хелпера типа 1 (TH1): интерферон-γ (IFNγ) и фактор некроза опухоли (TNF), в ответ на интерлейкин (IL)-12, Ил-15 и Ил-187. Во время гомеостаза тканевые резиденты ILC1 секретируют трансформирующий фактор роста β (TGF-β), чтобы стимулировать пролиферацию эпителия и ремоделированиематрицы 8. ILC типа 2 (ILC2s) в первую очередь реагируют на гельминтную инфекцию через секрецию цитокинов, ассоциированных с T-хелпером типа 2 (TH2): IL-4, IL-5 и IL-13, и характеризуются экспрессией ретиноевой кислоты, связанной с орфанным рецептором (ROR) α (ROR-α)9 и GATA-связывающим белком 3 (GATA-3)10,11,12 . У мышей кишечные «воспалительные» ILC2 дополнительно характеризуются экспрессией лектин-подобного рецептора клеток-киллеров (подсемейство G-член 1, KLRG)13, где они реагируют на эпителиальный пучко-клеточный IL-2514,15. Наконец, ILC типа 3, которые включают клетки индуктора лимфоидной ткани и хелпероподобные ILC типа 3 (ILC3s), зависят от транскрипционного фактора ROR-γt16 и группируются в группы, которые секретируют либо гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), IL-17 или IL-22 в ответ на местные сигналы IL-1β и IL-2317. Клетки-индукторы лимфоидной ткани группируются в пятнах Пейера и имеют решающее значение для развития этих вторичных лимфоидных органов во время развития18, тогда как ILC3s являются наиболее распространенным подтипом ILC во взрослой мочевой тонкой кишке lamina propria. Одна из самых ранних мышиных кишечных органоидных кокультурных систем с ILC3s была использована для того, чтобы отделить влияние цитокина IL-22 на сигнальный преобразователь и активатор транскрипции 3 (STAT-3), опосредованный лейцин-богатым повторением, содержащим рецептор, связанный с G-белком, 5 (Lgr5) + пролиферацию кишечных стволовых клеток19, мощный пример регенеративного ILC-эпителиального взаимодействия. ILC проявляют импринт-гетерогенность между органами 20,21 и проявляют пластичность между подмножествами в ответ на поляризующие цитокины22. То, что движет этими тканеспецифическими отпечатками и различиями в пластичности, и какую роль они играют в хронических заболеваниях, таких как ВЗК23, остаются захватывающими темами, которые могут быть решены с использованием органоидных кокультур.
Кишечные органоиды стали успешной и надежной моделью для изучения кишечного эпителия24,25. Они генерируются культивированием эпителиальных стволовых клеток Lgr5+ или целых изолированных крипт, которые включают клетки Paneth в качестве эндогенного источника члена семейства Wnt 3A (Wnt3a). Эти 3D-структуры поддерживаются либо в синтетических гидрогелях26, либо в биоматериалах, которые имитируют базальную lamina propria, например, термосшивающий базальный внеклеточный матрикс (TBEM), и дополнительно дополняются факторами роста, которые имитируют окружающую нишу, в первую очередь эпителиальным фактором роста (EGF), ингибитором костного морфогенетического белка (BMP) Ноггином и Lgr5-лигандом и Wnt-агонистом R-Spondin127. . В этих условиях органоиды сохраняют эпителиальную апико-базальную полярность и рекапитулируют крипто-ворсинчатую структуру кишечного эпителия с почковыми криптами стволовых клеток, которые терминально дифференцируются в абсорбирующие и секреторные клетки в центре органоида, которые затем сбрасываются во внутренний псевдолюменаноикисом 28. Хотя одни только кишечные органоиды были чрезвычайно выгодны в качестве редукционистских моделей развития и динамики эпителия в изоляции29,30, они обладают огромным будущим потенциалом для понимания того, как это поведение регулируется, влияет или даже нарушается иммунным компартментом.
В следующем протоколе описан метод кокультурирования между мышиными тонкокишечными органоидами и ILC1, полученными из lamina propria, который недавно был использован для определения того, как эта популяция неожиданно уменьшает кишечные сигнатуры воспаления и вместо этого способствует увеличению эпителиальной пролиферации через TGF-β в этой системе8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает методы установления органоидов тонкой кишки мышей, выделения редких ILC1 путем минимизации потери лимфоцитов во время протокола диссоциации кишечника и установления кокультур между этими двумя компартментами. В этом протоколе есть много шагов, и хотя некоторые …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Э.Р. получает степень доктора философии от Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). G.M.J. получает степень доктора философии от Wellcome Trust (203757/Z/16/A). D.C. признает докторскую степень студента от NIHR GSTT BRC. J.F.N. признает стипендию Марии Склодовской-Кюри, стипендию Королевской премии, стипендию Фонда Резерфорда RCUK /UKRI (MR/R024812/1) и премию Seed Award в области науки от Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Мы также благодарим основную команду проточной цитометрии BRC, базирующуюся в больнице Гая. Мыши-репортеры Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 были щедрым подарком от Г. Эберля (Институт Пастера, Париж, Франция). Мыши CD45.1 C57BL/6 были любезно предоставлены Т. Лоуренсом (Королевский колледж Лондона, Лондон) и. Барралом (Королевский колледж Лондона, Лондон).
Materials
| Reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-mouse CD45 (BV510) | BioLegend | 103137 | |
| Anti-mouse NK1.1 (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-5941-83 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| CD127 Monoclonal Antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-1271-82 | |
| CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0193-82 | |
| CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0051-82 | |
| CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0031-82 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423/10 | |
| COLLAGENASE D, 500MG | Merck | 11088866001 | |
| Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells | Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University) | ||
| DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) | Merck | 4942078001 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) | Gibco | 11320033 | |
| DNASE I, GRADE II | Merck | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) | Gibco | 21969-035 | |
| Ethilenediamine Tetraacetate Acid | Thermo Fisher Scientific | BP2482-100 | |
| FC block | 2B Scientific | BE0307 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated | Gibco | 10500064 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 3050-038 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14065056 | |
| HBSS (1X) | Gibco | 12549069 | |
| HEK-293T- mNoggin-Fc Cells | Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012). | ||
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) | Thermo Fisher Scientific | 46-5893-82 | |
| Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Thermo Fisher Scientific | L23105 | |
| Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-5931-82 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetylcysteine (500mM) | Merck | A9165 | |
| NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) | Thermo Fisher | 25-3351-82 | |
| PBS (1 X) 7.2 pH | Thermo Fisher Scientific | 12549079 | |
| PBS (10X) | Gibco | 70013032 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | |
| Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein | R&D Systems | AFL236 | |
| Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF | R&D Systems | 247-GMP | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier free) | BioLegend | 589106 | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) | R&D Systems | 407-ML-005/CF | |
| UltraComp eBeads | Thermo Fisher Scientific | 01-2222-42 | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Bio-techne | 1254 | |
| Plastics | |||
| 50 mL tube | Falcon | 10788561 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 30121023 | |
| 10 mL pippette | StarLab | E4860-0010 | |
| 15 mL tube | Falcon | 11507411 | |
| 25 mL pippette | StarLab | E4860-0025 | |
| p10 pippette tips | StarLab | S1121-3810-C | |
| p1000 pippette tips | StarLab | I1026-7810 | |
| p200 pippette tips | StarLab | E1011-0921 | |
| Standard tissue culture treated 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| CO2 and temperature controled incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R/S | |
| Flow Assisted Cellular Sorter | BD equipment | FACS Aria II | |
| Heated shaker | Stuart Equipment | SI500 | |
| Ice box | – | – | |
| Inverted light microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000) | |
| p10 pippette | Eppendorf | 3124000016 | |
| p1000 pippette | Eppendorf | 3124000063 | |
| p200 pippette | Eppendorf | 3124000032 | |
| Pippette gun | Eppendorf | 4430000018 | |
| Wet ice | – | – |
Referências
- Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).
- Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis. Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).
- Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
- Vivier, E., et al. Innate lymphoid cells: 10 years on. Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).
- Klose, C. S. N., et al. Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages. Cell. 157 (2), 340-356 (2014).
- Bernink, J. H., et al. Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria. Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).
- Jowett, G. M., et al. ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling. Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).
- Wong, S. H., et al. Transcription factor RORα is critical for nuocyte development. Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).
- Neill, D. R., et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity. Nature. 464, 1367-1370 (2010).
- Mjösberg, J., et al. The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential ‘inflammatory’ type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529, 221-225 (2016).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529, 226-230 (2016).
- Eberl, G., et al. An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells. Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells–a proposal for uniform nomenclature. Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).
- Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells. Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).
- Lindemans, C. A., et al. Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration. Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).
- Meininger, I., et al. Tissue-specific features of innate lymphoid cells. Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).
- Dutton, E. E., et al. Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity. Wellcome Open Research. 2, 117 (2018).
- Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. Plasticity of innate lymphoid cell subsets. Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).
- Bernink, J. H., et al. Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues. Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2012).
- Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).
- Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Biologia do Desenvolvimento. 420 (2), 262-270 (2016).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Tallapragada, N. P., et al. Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids. Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281 (2018).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- O’Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
- Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Cardoso, V., et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).
- Gury-BenAri, M., et al. The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome. Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).
- Seehus, C., Kaye, J. In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells. Bio-protocol. 6 (6), 1770 (2016).
