Cocultivo de organoides epiteliales del intestino delgado murino con células linfoides innatas
Summary
Este protocolo ofrece instrucciones detalladas para establecer organoides murinos del intestino delgado, aislar las células linfoides innatas tipo 1 de la lámina propia del intestino delgado murino y establecer cocultivos tridimensionales (3D) entre ambos tipos de células para estudiar las interacciones bidireccionales entre las células epiteliales intestinales y las células linfoides innatas tipo 1.
Abstract
Los cocultivos complejos de organoides con células inmunes proporcionan una herramienta versátil para interrogar las interacciones bidireccionales que sustentan el delicado equilibrio de la homeostasis de la mucosa. Estos sistemas multicelulares en 3D ofrecen un modelo reduccionista para abordar las enfermedades multifactoriales y resolver las dificultades técnicas que surgen al estudiar tipos de células raras, como las células linfoides innatas residentes en los tejidos (ILC). Este artículo describe un sistema murino que combina organoides del intestino delgado y láminas del intestino delgado derivadas de ILC tipo 1 (ILC1), que se pueden extender fácilmente a otras poblaciones de ILC o inmunes. Las ILC son una población residente en el tejido que está particularmente enriquecida en la mucosa, donde promueven la homeostasis y responden rápidamente al daño o la infección. Los cocultivos organoides con ILC ya han comenzado a arrojar luz sobre nuevos módulos de señalización epitelial-inmune en el intestino, revelando cómo los diferentes subconjuntos de ILC afectan la integridad y la regeneración de la barrera epitelial intestinal. Este protocolo permitirá nuevas investigaciones sobre las interacciones recíprocas entre las células epiteliales e inmunes, que tienen el potencial de proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos de la homeostasis y la inflamación de la mucosa.
Introduction
La comunicación entre el epitelio intestinal y el sistema inmunitario residente en el intestino es fundamental para el mantenimiento de la homeostasis intestinal1. Las interrupciones de estas interacciones se asocian con enfermedades locales y sistémicas, incluida la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y los cánceres gastrointestinales2. Un ejemplo notable de un regulador crítico de la homeostasis descrito más recientemente proviene del estudio de las células linfoides innatas (ILC), que han surgido como actores clave en el panorama inmunológico intestinal3. Las ILC son un grupo de células inmunes innatas heterogéneas que regulan la homeostasis intestinal y orquestan la inflamación en gran medida a través de la señalización mediada por citoquinas4.
Las ILC murinas se dividen ampliamente en subtipos basados en los perfiles de expresión de factores de transcripción, receptores y citoquinas5. Las ILC de tipo 1, que incluyen células asesinas naturales (NK) citotóxicas y ILC tipo 1 similares a las auxiliares (ILC1), se definen por la expresión del factor de transcripción (eomesodermina) Eomes y la proteína T-box expresadas en células T (T-bet)6, respectivamente, y secretan citoquinas asociadas con la inmunidad T helper tipo 1 (TH1): interferón-γ (IFNγ) y factor de necrosis tumoral (TNF), en respuesta a la interleucina (IL)-12, IL-15 e IL-187. Durante la homeostasis, los ILC1 residentes en el tejido secretan factor de crecimiento transformador β (TGF-β) para impulsar la proliferación epitelial y la remodelación de la matriz8. Las ILC tipo 2 (ILC2) responden principalmente a la infección por helmintos a través de la secreción de citoquinas asociadas al T ayudante tipo 2 (TH2): IL-4, IL-5 e IL-13, y se caracterizan por la expresión del receptor huérfano relacionado con el ácido retinoico (ROR) α (ROR-α)9 y la proteína de unión a GATA 3 (GATA-3)10,11,12 . En ratones, las ILC2 “inflamatorias” intestinales se caracterizan además por la expresión del receptor similar a la lectina de células asesinas (miembro G de la subfamilia G 1, KLRG)13 donde responden a il-25 derivada de células epiteliales del mechón14,15. Finalmente, las ILC tipo 3, que incluyen células inductoras de tejido linfoide y ILC tipo 3 similares a ayudantes (ILC3), dependen del factor de transcripción ROR-γt16 y se agrupan en grupos que secretan factor estimulante de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF), IL-17 o IL-22 en respuesta a las señales locales de IL-1β e IL-2317. Las células inductoras de tejido linfoide se agrupan en los parches de Peyer y son cruciales para el desarrollo de estos órganos linfoides secundarios durante el desarrollo18, mientras que las ILC3 son el subtipo de ILC más abundante en la lámina propia del intestino delgado murino adulto. Uno de los primeros sistemas de cocultivo de organoides intestinales murinos con ILC3 se aprovechó para separar el impacto de la citoquina IL-22 en el transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT-3) mediado por la repetición rica en leucina que contiene el receptor acoplado a proteína G 5 (Lgr5) + proliferación de células madre intestinales19, un poderoso ejemplo de una interacción regenerativa ILC-epitelial. Las ILC exhiben impronta-heterogeneidad entre órganos20,21 y exhiben plasticidad entre subconjuntos en respuesta a citoquinas polarizantes22. Lo que impulsa estas huellas específicas de los tejidos y las diferencias de plasticidad, y qué papel desempeñan en enfermedades crónicas como la EII23, siguen siendo temas emocionantes que podrían abordarse utilizando cocultivos organoides.
Los organoides intestinales han surgido como un modelo exitoso y fiable para estudiar el epitelio intestinal24,25. Estos se generan mediante el cultivo de células madre epiteliales intestinales Lgr5 +, o criptas aisladas completas, que incluyen células de Paneth como una fuente endógena de Wnt Family Member 3A (Wnt3a). Estas estructuras 3D se mantienen en hidrogeles sintéticos26 o en biomateriales que imitan la lámina basal propia, por ejemplo, la matriz extracelular basal de reticulación térmica (TBEM), y se complementan con factores de crecimiento que imitan el nicho circundante, especialmente el factor de crecimiento epitelial (EGF), el inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP) Noggin, y un ligando Lgr5 y un agonista Wnt R-Spondin127 . Bajo estas condiciones, los organoides mantienen la polaridad epitelial apico-basal y recapitulan la estructura cripta-vellosidad del epitelio intestinal con criptas de células madre en ciernes que se diferencian terminalmente en células absorbentes y secretoras en el centro del organoide, que luego se desprenden en el pseudoplume interno por anoikis28. Aunque los organoides intestinales por sí solos han sido enormemente ventajosos como modelos reduccionistas del desarrollo epitelial y la dinámica en aislamiento29,30, tienen un tremendo potencial futuro para comprender cómo estos comportamientos son regulados, influenciados o incluso interrumpidos por el compartimiento inmune.
En el siguiente protocolo se describe un método de cocultivo entre organoides del intestino delgado murino y lámina propia derivada de ILC1s, que se utilizó recientemente para identificar cómo esta población disminuye inesperadamente las firmas intestinales de inflamación y en su lugar contribuye a aumentar la proliferación epitelial a través de TGF-β en este sistema8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe los métodos para establecer organoides murinos del intestino delgado, aislar ILC1 raro minimizando la pérdida de linfocitos durante el protocolo de disociación intestinal y establecer cocultivos entre estos dos compartimentos. Hay muchos pasos para este protocolo, y aunque algunos son específicos de las ILC1, este enfoque se puede aplicar a otros tipos de células inmunes intestinales, y las configuraciones de cocultivo se pueden adaptar modularmente para adaptarse a preguntas de investigació…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.R. reconoce una beca de doctorado del Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). G.M.J. reconoce una beca de doctorado del Wellcome Trust (203757/Z/16/A). D.C. reconoce una beca de doctorado del NIHR GSTT BRC. J.F.N. reconoce una beca Marie Skłodowska-Curie, una beca del Premio del Rey, una beca del Fondo RCUK/UKRI Rutherford (MR/R024812/1) y un Premio Semilla en Ciencia del Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). También agradecemos al equipo central de citometría de flujo BRC con sede en Guy’s Hospital. Los ratones reporteros Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 fueron un generoso regalo de G. Eberl (Institut Pasteur, París, Francia). Los ratones CD45.1 C57BL/6 fueron amablemente administrados por T. Lawrence (King’s College London, Londres) y P. Barral (King’s College London, Londres).
Materials
| Reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-mouse CD45 (BV510) | BioLegend | 103137 | |
| Anti-mouse NK1.1 (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-5941-83 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| CD127 Monoclonal Antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-1271-82 | |
| CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0193-82 | |
| CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0051-82 | |
| CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0031-82 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423/10 | |
| COLLAGENASE D, 500MG | Merck | 11088866001 | |
| Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells | Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University) | ||
| DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) | Merck | 4942078001 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) | Gibco | 11320033 | |
| DNASE I, GRADE II | Merck | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) | Gibco | 21969-035 | |
| Ethilenediamine Tetraacetate Acid | Thermo Fisher Scientific | BP2482-100 | |
| FC block | 2B Scientific | BE0307 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated | Gibco | 10500064 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 3050-038 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14065056 | |
| HBSS (1X) | Gibco | 12549069 | |
| HEK-293T- mNoggin-Fc Cells | Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012). | ||
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) | Thermo Fisher Scientific | 46-5893-82 | |
| Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Thermo Fisher Scientific | L23105 | |
| Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-5931-82 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetylcysteine (500mM) | Merck | A9165 | |
| NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) | Thermo Fisher | 25-3351-82 | |
| PBS (1 X) 7.2 pH | Thermo Fisher Scientific | 12549079 | |
| PBS (10X) | Gibco | 70013032 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | |
| Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein | R&D Systems | AFL236 | |
| Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF | R&D Systems | 247-GMP | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier free) | BioLegend | 589106 | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) | R&D Systems | 407-ML-005/CF | |
| UltraComp eBeads | Thermo Fisher Scientific | 01-2222-42 | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Bio-techne | 1254 | |
| Plastics | |||
| 50 mL tube | Falcon | 10788561 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 30121023 | |
| 10 mL pippette | StarLab | E4860-0010 | |
| 15 mL tube | Falcon | 11507411 | |
| 25 mL pippette | StarLab | E4860-0025 | |
| p10 pippette tips | StarLab | S1121-3810-C | |
| p1000 pippette tips | StarLab | I1026-7810 | |
| p200 pippette tips | StarLab | E1011-0921 | |
| Standard tissue culture treated 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| CO2 and temperature controled incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R/S | |
| Flow Assisted Cellular Sorter | BD equipment | FACS Aria II | |
| Heated shaker | Stuart Equipment | SI500 | |
| Ice box | – | – | |
| Inverted light microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000) | |
| p10 pippette | Eppendorf | 3124000016 | |
| p1000 pippette | Eppendorf | 3124000063 | |
| p200 pippette | Eppendorf | 3124000032 | |
| Pippette gun | Eppendorf | 4430000018 | |
| Wet ice | – | – |
Referências
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