Evaluatie van substraatubiquitylering door E3 Ubiquitine-ligase in zoogdiercellysaten
Summary
We bieden een gedetailleerd protocol voor een alomtegenwoordyleringstest van een specifiek substraat en een E3-ubiquitine-ligase in zoogdiercellen. HEK293T-cellijnen werden gebruikt voor eiwitoverexpressie, het polyubiquityleerde substraat werd gezuiverd uit cellysaten door immunoprecipitatie en opgelost in SDS-PAGE. Immunoblotting werd gebruikt om deze posttranslationele modificatie te visualiseren.
Abstract
Ubiquitylering is een posttranslationele modificatie die optreedt in eukaryote cellen die van cruciaal belang is voor de regulatie van verschillende biologische routes, waaronder celoverleving, proliferatie en differentiatie. Het is een omkeerbaar proces dat bestaat uit een covalente aanhechting van ubiquitine aan het substraat door een cascadereactie van ten minste drie verschillende enzymen, samengesteld uit E1 (Ubiquitine-activeringsenzym), E2 (Ubiquitine-conjugaterend enzym) en E3 (Ubiquitine-ligase-enzym). Het E3-complex speelt een belangrijke rol bij substraatherkenning en alomtegenwoordigheid. Hier wordt een protocol beschreven om substraatubiquitylering in zoogdiercellen te evalueren met behulp van voorbijgaande co-transfectie van een plasmide dat codeert voor het geselecteerde substraat, een E3-ubiquitineligase en een gelabeld ubiquitine. Vóór lysis worden de getransfecteerde cellen behandeld met de proteasoomremmer MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) om proteasomale afbraak van substraat te voorkomen. Bovendien wordt het celextract onderworpen aan kleinschalige immunoprecipitatie (IP) om het polyubiquityleerde substraat te zuiveren voor daaropvolgende detectie door western blotting (WB) met behulp van specifieke antilichamen voor ubiquitine-tag. Daarom wordt een consistent en ongecompliceerd protocol voor alomtegenwoordyleringstest in zoogdiercellen beschreven om wetenschappers te helpen bij het aanpakken van alomtegenwoordigheid van specifieke substraten en E3-ubiquitine-ligases.
Introduction
Posttranslationele modificaties (PTM’s) zijn een belangrijk mechanisme met betrekking tot eiwitregulatie, wat essentieel is voor celhomeostase. Eiwitubiquitylering is een dynamische en ingewikkelde modificatie die een assortiment van verschillende signalen creëert die resulteren in verschillende cellulaire uitkomsten in eukaryote organismen. Ubiquitylering is een omkeerbaar proces dat bestaat in de aanhechting van een ubiquitine-eiwit met 76 aminozuren aan het substraat, dat plaatsvindt in een enzymatische cascade bestaande uit drie verschillende reacties1. De eerste stap wordt gekenmerkt door ubiquitine-activering, die afhankelijk is van een ATP-hydrolyse om een hoogenergetisch thioester-gebonden ubiquitine te vormen tussen de ubiquitine C-terminus en het cysteïneresidu dat aanwezig is op de actieve plaats van het E1-enzym. Vervolgens wordt het ubiquitine overgebracht naar het E2-enzym dat een thioester-achtig complex vormt met het ubiquitine. Daarna wordt het ubiquitine covalent aan het substraat gehecht door de E2, of vaker, door het E3-enzym, dat het substraat herkent enermee interageert 2,3. Af en toe zijn E4-enzymen (Ubiquitine-keten rekfactoren) nodig om multiubiquitineketenassemblage te bevorderen3.
Ubiquitine heeft zeven lysineresiduen (K6, K11, K27, K29, K33, K48 en K63), waardoor de vorming van polyubiquitineketens mogelijk is die verschillende koppelingen genereren om verschillende driedimensionale structuren te produceren die door verschillende effectoreiwitten zullen worden herkend 4,5. Daarom is het soort polyubiquitineketen dat in het substraat wordt geïntroduceerd essentieel om het lot van de cel te bepalen 6,7,8. Bovendien kan het substraat ook worden alomtegenwoordig via zijn N-terminale residuen die N-degrons worden genoemd. Specifieke E3-ubiquitine-ligases zijn verantwoordelijk voor N-degron-herkenning, waardoor de polyubiquitylering van nabijgelegen lysineresidu9 mogelijk is.
Tegenwoordig zijn er meer dan 40 verschillende SCF-specifieke substraten gekarakteriseerd. Onder die, belangrijke regulatoren van verschillende biologische routes, waaronder celdifferentiatie en ontwikkeling, evenals celoverleving en dood, kunnen worden gevonden 10,11,12,13. De identificatie van specifieke substraten van elke E3-ubiquitine-ligase is dus essentieel om een uitgebreide kaart van verschillende biologische gebeurtenissen te ontwerpen. Hoewel de identificatie van echte substraten biochemisch uitdagend is, is het gebruik van biochemische methoden zeer geschikt om ketenspecificiteit en het onderscheid tussen mono- en polyubiquitylering te evalueren14. Deze studie beschrijft een compleet protocol voor ubiquityleringstest met behulp van de zoogdiercellijn HEK293T die het substraat UXT-V2 (Ubiquitously expressed prefoldin-like chaperone isoform 2) overexpressie met het E3 ubiquitine-ligase complex SCF (Fbxo7). UXT-V2 is een essentiële co-factor voor NF-κB-signalering, en zodra dit eiwit in cellen wordt neergehaald, remt het TNF-α-geïnduceerde NF-κB-activering11. Om polyubiquitylated UXT-V2 te detecteren, wordt de proteasoomremmer MG132 gebruikt, omdat deze het vermogen heeft om de proteolytische activiteit van de 26S-subeenheid van het proteasoomcomplex15 te blokkeren. Bovendien wordt het celextract onderworpen aan een kleinschalig IP om het substraat te zuiveren, met behulp van een specifiek antilichaam geïmmobiliseerd tot agarosehars voor latere detectie door WB met behulp van geselecteerde antilichamen. Dit protocol is zeer nuttig om substraatubiquitylering in de cellulaire omgeving te valideren, en het kan ook worden aangepast voor verschillende soorten zoogdiercellen en andere E3 ubiquitine-ligasecomplexen. Het is echter noodzakelijk om het geteste substraat ook te valideren door middel van een in vitro ubiquityleringstest, omdat beide protocollen elkaar aanvullen met betrekking tot de identificatie van echte substraten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ubiquitylering is een essentiële posttranslationele modificatie die de niveaus van verschillende eiwitten reguleert en een cruciale rol speelt in veel signaalroutes en biologische processen, waardoor een gezonde intracellulaire omgeving wordt gewaarborgd. Het ubiquitine-proteasoomsysteem (UPS) is een van de belangrijkste aandachtspunten van recent farmaceutisch onderzoek en biedt de mogelijkheid om tumorsuppressoren te stabiliseren of de afbraak van oncogene producten te induceren22. De afwijkend…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
F.R.T wordt ondersteund door FAPESP-subsidienummer 2020/15771-6 en CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P en V.S worden ondersteund door CAPES. C.R.S.T.B.C werd ondersteund door FAPESP-beursnummer 2019/23466-1. Wij danken Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) voor de materiële ondersteuning.
Materials
| 1.5 mL microtube | Axygen | PMI110-06A | |
| 100 mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL tube | Corning | 430766 | |
| 96-well plate | Cralplast | 655111 | |
| Agarose-anti-HA beads | Sigma-Aldrich | E6779 | |
| Anti Mouse antibody | Seracare | 5220-0341 | Goat anti-Mouse IgG |
| Anti Rabbit antibody | Seracare | 5220-0337 | Goat anti-Rabbit IgG |
| Anti-Actin antibody | Sigma-Aldrich | A3853 | Dilution used: 1:2000 |
| Anti-Fbxo7 antibody | Sigma-Aldrich | SAB1407251 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H3663 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-Myc antibody | Cell Signalling | 2272 | Dilution used: 1:1000 |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-100G | Bovine Serum Albumin |
| Cell incubator | Nuaire | NU-4850 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | 500 x g for 5 min |
| ChemiDoc | BioRad | ||
| Digital pH meter | Kasvi | K39-2014B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | 10-017-CRV | High glucose |
| Fetal bovine serum | Gibco | F4135 | Filtrate prior use |
| HA peptide | Sigma-Aldrich | I2149 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| KCl | VWR Life Science | 0365-500G | |
| Kline rotator | Global Trade Technology | GT-2OIBD | |
| MG-132 | Boston Biochem | I-130 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418R | |
| Na3VO4 (Ortovanadato) | |||
| NaF | |||
| Nitrocellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600016 | |
| NP40 (IGEPAL CA-630) | Sigma-Aldrich | I8896-100ML | |
| Optical microscope | OPTIKA microscopes | SN510768 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | V79020 | For mammalian expression |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367 | |
| pcDNA3-UXTV2-HA | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI | |
| Pen Strep Glutamine 100x | Gibco | 10378-016 | |
| Phosphate buffered saline 10x | AccuGENE | 51226 | To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| Ponceau S | VWR Life Science | 0860-50G | |
| Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Rocking Shaker | Kasvi | 19010005 | |
| SDS-PAGE system | BioRad | 165-8004 | |
| Solution Homogenizer | Phoenix Luferco | AP-22 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| Trypsine (TrypLe Express) | Gibco | 12605-028 | |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 |
Referências
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Callis, J. The ubiquitination machinery of the ubiquitin system. The Arabidopsis Book. 12, 0174 (2014).
- Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
- French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7 (1), 6 (2021).
- Komander, D., et al. Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143 (5), 682-685 (2010).
- Davies, B. A., et al. Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).
- Raasi, S., Wolf, D. H. Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome. Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).
- Pan, M., et al. Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination. Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).
- Raducu, M., et al. SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development. The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).
- Spagnol, V., et al. The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1865 (1), 129754 (2021).
- Teixeira, F. R., et al. Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson’s disease. Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).
- Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover. Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).
- van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M. Visualizing ubiquitination in mammalian cells. EMBO Reports. 20 (2), 1-18 (2019).
- Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates. Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).
- Bradford, M. A. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 228, 726-734 (1970).
- Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -. H., Nothwang, H. G. Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue. Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).
- Huang, Y., et al. UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria. The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).
- Huang, Y., et al. UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).
- Sun, S., et al. UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome. The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).
- Huang, X., Dixit, V. M. Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development. Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).
- Rajkumar, S. V. Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).
- Hideshima, T., et al. The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells. Pesquisa do Câncer. 61 (7), 3071-3076 (2001).
- Tietsche, V., et al. New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Kuiken, H. J., et al. Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).
- Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
- Iconomou, M., Saunders, D. N. Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates. Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).
- Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER. Cell. 154 (3), 609-622 (2013).
- Hunter, T. The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).
