Evaluering af substratubiquitylation af E3 Ubiquitin-ligase i pattedyrcellelysater
Summary
Vi leverer en detaljeret protokol til et allestedsnærværende assay af et specifikt substrat og en E3 ubiquitin-ligase i pattedyrceller. HEK293T-cellelinjer blev anvendt til proteinoverekspression, det polyubiquitylerede substrat blev oprenset fra cellelysater ved immunoprecipitation og løst i SDS-PAGE. Immunoblotting blev brugt til at visualisere denne posttranslationelle modifikation.
Abstract
Ubiquitylation er en posttranslationel modifikation, der forekommer i eukaryote celler, der er kritisk for flere biologiske vejes regulering, herunder celleoverlevelse, proliferation og differentiering. Det er en reversibel proces, der består af en kovalent binding af ubiquitin til substratet gennem en kaskadereaktion af mindst tre forskellige enzymer, sammensat af E1 (Ubiquitin-aktiveringsenzym), E2 (Ubiquitin-konjugerende enzym) og E3 (Ubiquitin-ligaseenzym). E3-komplekset spiller en vigtig rolle i substratgenkendelse og allestedsnærværende. Her beskrives en protokol til evaluering af substratubiquitylation i pattedyrceller ved anvendelse af forbigående co-transfektion af et plasmid, der koder for det valgte substrat, en E3 ubiquitin ligase og et mærket ubiquitin. Før lysis behandles de transinficerede celler med proteasomhæmmeren MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) for at undgå substrat proteasomal nedbrydning. Desuden underkastes celleekstraktet til småskala immunoprecipitation (IP) for at rense det polyubiquitylerede substrat til efterfølgende påvisning ved western blotting (WB) ved anvendelse af specifikke antistoffer til ubiquitinmærke. Derfor beskrives en konsistent og ukompliceret protokol til allestedsnærværende assay i pattedyrceller for at hjælpe forskere med at adressere allestedsnærværende substrater og E3 ubiquitin-ligaser.
Introduction
Posttranslationelle modifikationer (PTM’er) er en vigtig mekanisme vedrørende proteinregulering, hvilket er afgørende for cellehomeostase. Protein allestedsnærværende er en dynamisk og indviklet modifikation, der skaber et udvalg af forskellige signaler, hvilket resulterer i flere cellulære resultater i eukaryote organismer. Ubiquitylation er en reversibel proces bestående i binding af et ubiquitinprotein indeholdende 76 aminosyrer til substratet, der forekommer i en enzymatisk kaskade sammensat af tre forskellige reaktioner1. Det første trin er kendetegnet ved ubiquitinaktivering, som afhænger af en ATP-hydrolyse for at danne et højenergi-thioesterbundet ubiquitin mellem ubiquitin C-terminalen og cysteinresten til stede i det aktive sted af E1-enzymet. Derefter overføres ubiquitin til E2-enzymet, der danner et thioester-lignende kompleks med ubiquitin. Derefter bindes ubiquitin kovalent til substratet af E2 eller oftere af E3-enzymet, som genkender og interagerer med substratet 2,3. Lejlighedsvis er E4-enzymer (Ubiquitin-kædeforlængelsesfaktorer) nødvendige for at fremme multiubiquitinkædesamling3.
Ubiquitin har syv lysinrester (K6, K11, K27, K29, K33, K48 og K63), hvilket gør det muligt at danne polyubiquitinkæder, der genererer forskellige forbindelser til at producere forskellige tridimensionelle strukturer, der vil blive genkendt af flere effektorproteiner 4,5. Derfor er den slags polyubiquitinkæde, der introduceres i substratet, afgørende for at bestemme dens celle skæbne 6,7,8. Desuden kunne substratet også være allestedsnærværende gennem dets N-terminale rester kaldet N-degroner. Specifikke E3 ubiquitin-ligaser er ansvarlige for N-degrongenkendelse, hvilket muliggør polyubiquitylation af nærliggende lysinrester9.
I dag er der mere end 40 forskellige SCF-specifikke substrater karakteriseret. Blandt disse kan nøgleregulatorer af flere biologiske veje, herunder celledifferentiering og udvikling samt celleoverlevelse og død, findes 10,11,12,13. Således er identifikationen af specifikke substrater af hver E3 ubiquitin-ligase afgørende for at designe et omfattende kort over forskellige biologiske begivenheder. Selvom identifikationen af sande substrater er biokemisk udfordrende, er brugen af biokemibaserede metoder meget velegnet til at evaluere kædespecificitet og sondringen mellem mono- og polyubiquitylation14. Denne undersøgelse beskriver en komplet protokol til allestedsnærværende assay ved hjælp af pattedyrcellelinjen HEK293T, der overudtrykker substratet UXT-V2 (allestedsnærværende udtrykt præfoldinlignende chaperone isoform 2) med E3 ubiquitin-ligasekomplekset SCF (Fbxo7). UXT-V2 er en væsentlig co-faktor for NF-κB-signalering, og når dette protein er slået ned i celler, hæmmer det TNF-α-induceret NF-κB-aktivering11. For at detektere polyubiquityleret UXT-V2 anvendes proteasomhæmmeren MG132 således, da den har evnen til at blokere den proteolytiske aktivitet af 26S-underenheden af proteasomkomplekset15. Desuden underkastes celleekstraktet til en lille IP for at rense substratet ved anvendelse af et specifikt antistof immobiliseret til agaroseharpiks til efterfølgende påvisning af WB ved anvendelse af udvalgte antistoffer. Denne protokol er meget nyttig til at validere substrat allestedsnærværende i det cellulære miljø, og den kan også tilpasses til forskellige typer pattedyrceller og andre E3 ubiquitin-ligasekomplekser. Det er imidlertid nødvendigt også at validere substratet testet gennem et in vitro ubiquitylationsassay, da begge protokoller supplerer hinanden med hensyn til identifikation af sande substrater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ubiquitylation er en væsentlig posttranslationel modifikation, der regulerer niveauerne af flere proteiner og spiller en afgørende rolle i mange signalveje og biologiske processer, hvilket sikrer et sundt intracellulært miljø. Det ubiquitin-proteasomsystem (UPS) er et af hovedfokuserne for nyere farmaceutisk forskning, hvilket giver mulighed for at stabilisere tumorundertrykkere eller fremkalde nedbrydning af onkogene produkter22. For eksempel fremmer den afvigende proliferation af plasmacelle…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
F.R.T er støttet af FAPESP-tilskudsnummer 2020/15771-6 og CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P og V.S understøttes af CAPES. C.R.S.T.B.C blev støttet af FAPESP-stipendienummer 2019/23466-1. Vi takker Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) for den materielle støtte.
Materials
| 1.5 mL microtube | Axygen | PMI110-06A | |
| 100 mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL tube | Corning | 430766 | |
| 96-well plate | Cralplast | 655111 | |
| Agarose-anti-HA beads | Sigma-Aldrich | E6779 | |
| Anti Mouse antibody | Seracare | 5220-0341 | Goat anti-Mouse IgG |
| Anti Rabbit antibody | Seracare | 5220-0337 | Goat anti-Rabbit IgG |
| Anti-Actin antibody | Sigma-Aldrich | A3853 | Dilution used: 1:2000 |
| Anti-Fbxo7 antibody | Sigma-Aldrich | SAB1407251 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H3663 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-Myc antibody | Cell Signalling | 2272 | Dilution used: 1:1000 |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-100G | Bovine Serum Albumin |
| Cell incubator | Nuaire | NU-4850 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | 500 x g for 5 min |
| ChemiDoc | BioRad | ||
| Digital pH meter | Kasvi | K39-2014B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | 10-017-CRV | High glucose |
| Fetal bovine serum | Gibco | F4135 | Filtrate prior use |
| HA peptide | Sigma-Aldrich | I2149 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| KCl | VWR Life Science | 0365-500G | |
| Kline rotator | Global Trade Technology | GT-2OIBD | |
| MG-132 | Boston Biochem | I-130 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418R | |
| Na3VO4 (Ortovanadato) | |||
| NaF | |||
| Nitrocellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600016 | |
| NP40 (IGEPAL CA-630) | Sigma-Aldrich | I8896-100ML | |
| Optical microscope | OPTIKA microscopes | SN510768 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | V79020 | For mammalian expression |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367 | |
| pcDNA3-UXTV2-HA | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI | |
| Pen Strep Glutamine 100x | Gibco | 10378-016 | |
| Phosphate buffered saline 10x | AccuGENE | 51226 | To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| Ponceau S | VWR Life Science | 0860-50G | |
| Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Rocking Shaker | Kasvi | 19010005 | |
| SDS-PAGE system | BioRad | 165-8004 | |
| Solution Homogenizer | Phoenix Luferco | AP-22 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| Trypsine (TrypLe Express) | Gibco | 12605-028 | |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 |
Referências
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Callis, J. The ubiquitination machinery of the ubiquitin system. The Arabidopsis Book. 12, 0174 (2014).
- Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
- French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7 (1), 6 (2021).
- Komander, D., et al. Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143 (5), 682-685 (2010).
- Davies, B. A., et al. Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).
- Raasi, S., Wolf, D. H. Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome. Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).
- Pan, M., et al. Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination. Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).
- Raducu, M., et al. SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development. The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).
- Spagnol, V., et al. The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1865 (1), 129754 (2021).
- Teixeira, F. R., et al. Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson’s disease. Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).
- Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover. Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).
- van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M. Visualizing ubiquitination in mammalian cells. EMBO Reports. 20 (2), 1-18 (2019).
- Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates. Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).
- Bradford, M. A. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 228, 726-734 (1970).
- Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -. H., Nothwang, H. G. Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue. Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).
- Huang, Y., et al. UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria. The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).
- Huang, Y., et al. UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).
- Sun, S., et al. UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome. The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).
- Huang, X., Dixit, V. M. Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development. Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).
- Rajkumar, S. V. Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).
- Hideshima, T., et al. The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells. Pesquisa do Câncer. 61 (7), 3071-3076 (2001).
- Tietsche, V., et al. New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Kuiken, H. J., et al. Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).
- Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
- Iconomou, M., Saunders, D. N. Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates. Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).
- Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER. Cell. 154 (3), 609-622 (2013).
- Hunter, T. The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).
