Évaluation de l’ubiquitylation du substrat par l’ubiquitine-ligase E3 dans les lysats de cellules de mammifères
Summary
Nous fournissons un protocole détaillé pour un test d’ubiquitylation d’un substrat spécifique et d’une ubiquitine-ligase E3 dans des cellules de mammifères. Les lignées cellulaires HEK293T ont été utilisées pour la surexpression des protéines, le substrat polyubiquitylé a été purifié des lysats cellulaires par immunoprécipitation et résolu dans SDS-PAGE. L’immunoblotting a été utilisé pour visualiser cette modification post-traductionnelle.
Abstract
L’ubiquitylation est une modification post-traductionnelle qui se produit dans les cellules eucaryotes et qui est essentielle à la régulation de plusieurs voies biologiques, y compris la survie, la prolifération et la différenciation cellulaires. Il s’agit d’un processus réversible qui consiste en une fixation covalente de l’ubiquitine au substrat par une réaction en cascade d’au moins trois enzymes différentes, composées de E1 (enzyme d’activation de l’ubiquitine), E2 (enzyme conjuguant l’ubiquitine) et E3 (enzyme ubiquitine-ligase). Le complexe E3 joue un rôle important dans la reconnaissance et l’ubiquitylation du substrat. Ici, un protocole est décrit pour évaluer l’ubiquitylation du substrat dans les cellules de mammifères en utilisant la co-transfection transitoire d’un plasmide codant pour le substrat sélectionné, une ligase d’ubiquitine E3 et une ubiquitine marquée. Avant la lyse, les cellules transfectées sont traitées avec l’inhibiteur du protéasome MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) pour éviter la dégradation protéasomique du substrat. En outre, l’extrait cellulaire est soumis à une immunoprécipitation (IP) à petite échelle pour purifier le substrat polyubiquitylé en vue d’une détection ultérieure par transfert western (WB) à l’aide d’anticorps spécifiques pour l’étiquette ubiquitine. Par conséquent, un protocole cohérent et simple pour le dosage de l’ubiquitylation dans les cellules de mammifères est décrit pour aider les scientifiques à traiter l’ubiquitylation de substrats spécifiques et les ligas d’ubiquitine E3.
Introduction
Les modifications post-traductionnelles (PTM) sont un mécanisme important concernant la régulation des protéines, qui est essentielle pour l’homéostasie cellulaire. L’ubiquitylation des protéines est une modification dynamique et complexe qui crée un assortiment de différents signaux entraînant plusieurs résultats cellulaires chez les organismes eucaryotes. L’ubiquitylation est un processus réversible consistant en la fixation d’une protéine d’ubiquitine contenant 76 acides aminés au substrat, se produisant dans une cascade enzymatique composée de trois réactions distinctes1. La première étape est caractérisée par l’activation de l’ubiquitine, qui dépend d’une hydrolyse de l’ATP pour former une ubiquitine liée au thioester de haute énergie entre l’ubiquitine C-terminus et le résidu de cystéine présent dans le site actif de l’enzyme E1. Par la suite, l’ubiquitine est transférée à l’enzyme E2 formant un complexe semblable à un thioester avec l’ubiquitine. Par la suite, l’ubiquitine est fixée de manière covalente au substrat par l’E2, ou plus souvent, par l’enzyme E3, qui reconnaît et interagit avec le substrat 2,3. Parfois, des enzymes E4 (facteurs d’allongement de la chaîne ubiquitine) sont nécessaires pour favoriser l’assemblage de la chaîne multiubiquitine3.
L’ubiquitine a sept résidus de lysine (K6, K11, K27, K29, K33, K48 et K63), permettant la formation de chaînes de polyubiquitine qui génèrent des liaisons distinctes pour produire différentes structures tridimensionnelles qui vont être reconnues par plusieurs protéines effectrices 4,5. Par conséquent, le type de chaîne de polyubiquitine introduit dans le substrat est essentiel pour décider de son devenir cellulaire 6,7,8. De plus, le substrat pourrait également être ubiquitiné par ses résidus N-terminaux appelés N-dégrons. Les ubiquitine-ligases E3 spécifiques sont responsables de la reconnaissance du N-degron, permettant la polyubiquitylation du résidu de lysine9 à proximité.
De nos jours, il existe plus de 40 substrats différents spécifiques au SCF caractérisés. Parmi ceux-ci, les principaux régulateurs de plusieurs voies biologiques, y compris la différenciation et le développementcellulaires ainsi que la survie et la mort cellulaires, peuvent être trouvés 10,11,12,13. Ainsi, l’identification de substrats spécifiques de chaque ubiquitine-ligase E3 est essentielle pour concevoir une carte complète des différents événements biologiques. Même si l’identification de véritables substrats est biochimiquement difficile, l’utilisation de méthodes basées sur la biochimie est très appropriée pour évaluer la spécificité de la chaîne et la distinction entre mono- et polyubiquitylation14. Cette étude décrit un protocole complet pour le dosage de l’ubiquitylation utilisant la lignée cellulaire de mammifères HEK293T surexprimant le substrat UXT-V2 (Ubiquitously expressed prefoldin-like chaperone isoform 2) avec le complexe E3 ubiquitine-ligase SCF (Fbxo7). L’UXT-V2 est un cofacteur essentiel pour la signalisation NF-κB, et une fois que cette protéine est renversée dans les cellules, elle inhibe l’activation NF-κB induite par le TNF-α11. Ainsi, pour détecter l’UXT-V2 polyubiquitylé, l’inhibiteur du protéasome MG132 est utilisé puisqu’il a la capacité de bloquer l’activité protéolytique de la sous-unité 26S du complexe protéasome15. En outre, l’extrait cellulaire est soumis à une IP à petite échelle pour purifier le substrat, en utilisant un anticorps spécifique immobilisé en résine d’agarose pour une détection ultérieure par WB à l’aide d’anticorps sélectionnés. Ce protocole est très utile pour valider l’ubiquitylation du substrat dans l’environnement cellulaire, et il peut également être adapté à différents types de cellules de mammifères et à d’autres complexes E3 ubiquitine-ligase. Cependant, il est nécessaire de valider le substrat testé par un test d’ubiquitylation in vitro, car les deux protocoles se complètent en ce qui concerne l’identification de véritables substrats.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ubiquitylation est une modification post-traductionnelle essentielle qui régule les niveaux de plusieurs protéines et joue un rôle crucial dans de nombreuses voies de signalisation et processus biologiques, assurant un environnement intracellulaire sain. Le système ubiquitine-protéasome (UPS) est l’un des principaux axes de la recherche pharmaceutique récente, offrant la possibilité de stabiliser les suppresseurs de tumeurs ou d’induire la dégradation des produits oncogènes22. Par…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
F.R.T est soutenu par le numéro de subvention FAPESP 2020/15771-6 et CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P et V.S sont soutenus par CAPES. C.R.S.T.B.C a été soutenu par la bourse FAPESP numéro 2019/23466-1. Nous remercions Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) pour son soutien matériel.
Materials
| 1.5 mL microtube | Axygen | PMI110-06A | |
| 100 mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL tube | Corning | 430766 | |
| 96-well plate | Cralplast | 655111 | |
| Agarose-anti-HA beads | Sigma-Aldrich | E6779 | |
| Anti Mouse antibody | Seracare | 5220-0341 | Goat anti-Mouse IgG |
| Anti Rabbit antibody | Seracare | 5220-0337 | Goat anti-Rabbit IgG |
| Anti-Actin antibody | Sigma-Aldrich | A3853 | Dilution used: 1:2000 |
| Anti-Fbxo7 antibody | Sigma-Aldrich | SAB1407251 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H3663 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-Myc antibody | Cell Signalling | 2272 | Dilution used: 1:1000 |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-100G | Bovine Serum Albumin |
| Cell incubator | Nuaire | NU-4850 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | 500 x g for 5 min |
| ChemiDoc | BioRad | ||
| Digital pH meter | Kasvi | K39-2014B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | 10-017-CRV | High glucose |
| Fetal bovine serum | Gibco | F4135 | Filtrate prior use |
| HA peptide | Sigma-Aldrich | I2149 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| KCl | VWR Life Science | 0365-500G | |
| Kline rotator | Global Trade Technology | GT-2OIBD | |
| MG-132 | Boston Biochem | I-130 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418R | |
| Na3VO4 (Ortovanadato) | |||
| NaF | |||
| Nitrocellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600016 | |
| NP40 (IGEPAL CA-630) | Sigma-Aldrich | I8896-100ML | |
| Optical microscope | OPTIKA microscopes | SN510768 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | V79020 | For mammalian expression |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367 | |
| pcDNA3-UXTV2-HA | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI | |
| Pen Strep Glutamine 100x | Gibco | 10378-016 | |
| Phosphate buffered saline 10x | AccuGENE | 51226 | To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| Ponceau S | VWR Life Science | 0860-50G | |
| Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Rocking Shaker | Kasvi | 19010005 | |
| SDS-PAGE system | BioRad | 165-8004 | |
| Solution Homogenizer | Phoenix Luferco | AP-22 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| Trypsine (TrypLe Express) | Gibco | 12605-028 | |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 |
Referências
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Callis, J. The ubiquitination machinery of the ubiquitin system. The Arabidopsis Book. 12, 0174 (2014).
- Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
- French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7 (1), 6 (2021).
- Komander, D., et al. Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143 (5), 682-685 (2010).
- Davies, B. A., et al. Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).
- Raasi, S., Wolf, D. H. Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome. Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).
- Pan, M., et al. Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination. Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).
- Raducu, M., et al. SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development. The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).
- Spagnol, V., et al. The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1865 (1), 129754 (2021).
- Teixeira, F. R., et al. Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson’s disease. Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).
- Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover. Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).
- van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M. Visualizing ubiquitination in mammalian cells. EMBO Reports. 20 (2), 1-18 (2019).
- Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates. Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).
- Bradford, M. A. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 228, 726-734 (1970).
- Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -. H., Nothwang, H. G. Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue. Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).
- Huang, Y., et al. UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria. The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).
- Huang, Y., et al. UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).
- Sun, S., et al. UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome. The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).
- Huang, X., Dixit, V. M. Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development. Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).
- Rajkumar, S. V. Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).
- Hideshima, T., et al. The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells. Pesquisa do Câncer. 61 (7), 3071-3076 (2001).
- Tietsche, V., et al. New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Kuiken, H. J., et al. Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).
- Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
- Iconomou, M., Saunders, D. N. Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates. Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).
- Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER. Cell. 154 (3), 609-622 (2013).
- Hunter, T. The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).
