Avaliação da Ubiquização substrato por E3 Ubiquitin-ligase em Lysates de Células Mamárias
Summary
Fornecemos um protocolo detalhado para um ensaio de ubiquização de um substrato específico e uma ubiquitina-ligase E3 em células mamíferas. As linhas celulares HEK293T foram utilizadas para superexpressão de proteínas, o substrato poliubiquizado foi purificado a partir de lisestês celulares por imunoprecipitação, e resolvido em SDS-PAGE. A imunoblotação foi usada para visualizar esta modificação pós-translacional.
Abstract
A ubiquização é uma modificação pós-translacional que ocorre em células eucarióticas que é fundamental para a regulação de várias vias biológicas, incluindo sobrevivência celular, proliferação e diferenciação. É um processo reversível que consiste em um apego covalente da ubiquitina ao substrato através de uma reação em cascata de pelo menos três enzimas diferentes, compostas por E1 (enzima de ativação de ubiquitina), E2 (enzima conjugante de Ubiquitina) e E3 (enzima Ubiquitin-ligase). O complexo E3 desempenha um papel importante no reconhecimento e na ubiquização do substrato. Aqui, um protocolo é descrito para avaliar a ubiquização substrato em células mamíferas usando co-transfecção transitória de um plasmídeo codificando o substrato selecionado, uma liga ligase de ubiquitina E3 e uma ubiquitina marcada. Antes da lise, as células transfeinadas são tratadas com o inibidor proteasome MG132 (carbobenzoxy-leu-leucinal) para evitar a degradação proteasómal substrato. Além disso, o extrato celular é submetido à imunoprecipitação em pequena escala (IP) para purificar o substrato poliubiquítado para posterior detecção por mancha ocidental (WB) usando anticorpos específicos para a tag ubiquitina. Assim, um protocolo consistente e descomplicado para ensaio de onipresença em células de mamíferos é descrito para auxiliar os cientistas no enfrentamento da onipresençação de substratos específicos e ligaduras de ubiquína E3.
Introduction
As modificações pós-translacionais (PTMs) são um mecanismo importante no que diz respeito à regulação da proteína, essencial para a homeostase celular. A ubiquidade proteica é uma modificação dinâmica e intrincada que cria uma variedade de diferentes sinais resultando em vários desfechos celulares em organismos eucarióticos. A ubiquização é um processo reversível que consiste na fixação de uma proteína de ubiquitina contendo 76 aminoácidos ao substrato, ocorrendo em uma cascata enzimática composta por três reações distintas1. O primeiro passo é caracterizado pela ativação da ubiquitina, que depende de uma hidrólise ATP para formar uma oniquitina ligada a tioéster de alta energia entre a ubiquitina C-terminus e o resíduo de cisteína presente no local ativo da enzima E1. Posteriormente, a ubiquitina é transferida para a enzima E2 formando um complexo de tiaster com a ubiquitina. Posteriormente, a ubiquitina é covalentemente ligada ao substrato pelo E2, ou mais frequentemente, pela enzima E3, que reconhece e interage com o substrato 2,3. Ocasionalmente, enzimas E4 (fatores de alongamento da cadeia ubiquitina) são necessárias para promover o conjunto da cadeia multiubiquitina3.
A ubiquitina possui sete resíduos de linfino (K6, K11, K27, K29, K33, K48 e K63), permitindo a formação de cadeias de poliugentina que geram ligações distintas para produzir diferentes estruturas tridimensionais que serão reconhecidas por várias proteínasefeitoras 4,5. Assim, o tipo de cadeia de poliuforma introduzida no substrato é essencial para decidir seu destino celular 6,7,8. Além disso, o substrato também poderia ser ubiquitinado através de seus resíduos n-terminais chamados N-degrons. As ubiquína-ligases específicas E3 são responsáveis pelo reconhecimento de N-degron, permitindo a poliuubiquização do resíduo de liseínanas proximidades 9.
Atualmente, há mais de 40 substratos específicos do SCF caracterizados. Entre elas, podem ser encontrados 10,11,12,13, 12,13. Assim, a identificação de substratos específicos de cada ubiquitina-ligase E3 é essencial para projetar um mapa abrangente de vários eventos biológicos. Embora a identificação de substratos verdadeiros seja bioquimicamente desafiadora, o uso de métodos baseados em bioquímica é muito adequado para avaliar a especificidade da cadeia e a distinção entre mono e poliumipremiado14. Este estudo descreve um protocolo completo para ensaio de onipresença usando a linha celular de mamíferos HEK293T sobreexpressando o substrato UXT-V2 (onipresentemente expresso como acompanhante de ubimia 2) com o complexo e3 ubiquitin-ligase SCF(Fbxo7). O UXT-V2 é um cofator essencial para a sinalização NF-κB, e uma vez que essa proteína é derrubada nas células, inibe a ativação NF-κB induzida por TN α F11. Assim, para detectar o UXT-V2 poliutilítulo, o inibidor proteasome MG132 é utilizado, pois tem a capacidade de bloquear a atividade proteolítica da subunidade 26S do complexoproteasome 15. Além disso, o extrato celular é submetido a um IP de pequena escala para purificar o substrato, utilizando um anticorpo específico imobilizado para resina agarose para posterior detecção por WB usando anticorpos selecionados. Este protocolo é muito útil para validar a ubiquização do substrato no ambiente celular, e também pode ser adaptado para diferentes tipos de células mamíferas e outros complexos de ubiquitina-ligase E3. No entanto, é necessário validar o substrato testado através de um ensaio de onipresença in vitro também, uma vez que ambos os protocolos se complementam em relação à identificação de substratos verdadeiros.
Protocol
Representative Results
Discussion
A ubiquização é uma modificação pós-translacional essencial que regula os níveis de várias proteínas e desempenha um papel crucial em muitas vias de sinalização e processos biológicos, garantindo um ambiente intracelular saudável. O sistema ubiquitina-proteasome (UPS) é um dos principais focos de pesquisas farmacêuticas recentes, proporcionando a possibilidade de estabilizar supressores tumorais ou induzir a degradação de produtos oncogênicos22. Por exemplo, a proliferação aber…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O F.R.T é apoiado pelo número de bolsas da FAPESP nº 2020/15771-6 e cnpq universal 405836/2018-0. P.M.S.P e V.S são apoiados pela CAPES. C.R.S.T.B.C foi apoiado pela bolsa de estudos da FAPESP número 2019/23466-1. Agradecemos a Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) pelo apoio material.
Materials
| 1.5 mL microtube | Axygen | PMI110-06A | |
| 100 mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL tube | Corning | 430766 | |
| 96-well plate | Cralplast | 655111 | |
| Agarose-anti-HA beads | Sigma-Aldrich | E6779 | |
| Anti Mouse antibody | Seracare | 5220-0341 | Goat anti-Mouse IgG |
| Anti Rabbit antibody | Seracare | 5220-0337 | Goat anti-Rabbit IgG |
| Anti-Actin antibody | Sigma-Aldrich | A3853 | Dilution used: 1:2000 |
| Anti-Fbxo7 antibody | Sigma-Aldrich | SAB1407251 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H3663 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-Myc antibody | Cell Signalling | 2272 | Dilution used: 1:1000 |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-100G | Bovine Serum Albumin |
| Cell incubator | Nuaire | NU-4850 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | 500 x g for 5 min |
| ChemiDoc | BioRad | ||
| Digital pH meter | Kasvi | K39-2014B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | 10-017-CRV | High glucose |
| Fetal bovine serum | Gibco | F4135 | Filtrate prior use |
| HA peptide | Sigma-Aldrich | I2149 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| KCl | VWR Life Science | 0365-500G | |
| Kline rotator | Global Trade Technology | GT-2OIBD | |
| MG-132 | Boston Biochem | I-130 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418R | |
| Na3VO4 (Ortovanadato) | |||
| NaF | |||
| Nitrocellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600016 | |
| NP40 (IGEPAL CA-630) | Sigma-Aldrich | I8896-100ML | |
| Optical microscope | OPTIKA microscopes | SN510768 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | V79020 | For mammalian expression |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367 | |
| pcDNA3-UXTV2-HA | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI | |
| Pen Strep Glutamine 100x | Gibco | 10378-016 | |
| Phosphate buffered saline 10x | AccuGENE | 51226 | To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| Ponceau S | VWR Life Science | 0860-50G | |
| Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Rocking Shaker | Kasvi | 19010005 | |
| SDS-PAGE system | BioRad | 165-8004 | |
| Solution Homogenizer | Phoenix Luferco | AP-22 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| Trypsine (TrypLe Express) | Gibco | 12605-028 | |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 |
Referências
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