Utvärdering av substrat Ubiquitylation av E3 Ubiquitin-ligas i däggdjurscelllysater
Summary
Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för en ubiquitylationsanalys av ett specifikt substrat och en E3 ubiquitin-ligas i däggdjursceller. HEK293T-cellinjer användes för proteinöveruttryck, det polyubiquitylerade substratet renades från celllysater genom immunoprecipitation och löstes i SDS-PAGE. Immunoblotting användes för att visualisera denna post-translationella modifiering.
Abstract
Ubiquitylation är en post-translationell modifiering som sker i eukaryota celler som är avgörande för flera biologiska vägars reglering, inklusive cellöverlevnad, proliferation och differentiering. Det är en reversibel process som består av en kovalent bindning av ubiquitin till substratet genom en kaskadreaktion av minst tre olika enzymer, bestående av E1 (Ubiquitin-aktiveringsenzym), E2 (Ubiquitin-konjugerande enzym) och E3 (Ubiquitin-ligasenzym). E3-komplexet spelar en viktig roll i substratigenkänning och allestädes närvarande. Här beskrivs ett protokoll för att utvärdera substrat ubiquitylation i däggdjursceller med hjälp av övergående samtransfektion av en plasmid som kodar för det valda substratet, en E3 ubiquitinligas och en taggad ubiquitin. Före lysen behandlas de transfekterade cellerna med proteasomhämmaren MG132 (karbensoxi-leu-leu-leucinal) för att undvika substratproteasomal nedbrytning. Vidare utsätts cellextraktet för småskalig immunoprecipitation (IP) för att rena det polyubiquitylerade substratet för efterföljande detektion genom western blotting (WB) med användning av specifika antikroppar för ubiquitintagg. Därför beskrivs ett konsekvent och okomplicerat protokoll för ubiquitylationsanalys i däggdjursceller för att hjälpa forskare att ta itu med ubiquitylation av specifika substrat och E3-ubiquitin-ligaser.
Introduction
Post-translationella modifieringar (PTM) är en viktig mekanism för proteinreglering, vilket är viktigt för cellhomeostas. Protein ubiquitylation är en dynamisk och invecklad modifiering som skapar ett sortiment av olika signaler som resulterar i flera cellulära resultat i eukaryota organismer. Ubiquitylation är en reversibel process som består i bindning av ett ubiquitinprotein innehållande 76 aminosyror till substratet, som förekommer i en enzymatisk kaskad sammansatt av tre distinkta reaktioner1. Det första steget kännetecknas av ubiquitinaktivering, som beror på en ATP-hydrolys för att bilda ett tioesterbundet ubiquitin med hög energi mellan ubiquitin C-terminalen och cysteinresten som finns i det aktiva stället för E1-enzymet. Därefter överförs ubiquitinet till E2-enzymet som bildar ett tioester-gillat komplex med ubiquitinet. Därefter är ubiquitinet kovalent bundet till substratet av E2, eller oftare, av E3-enzymet, som känner igen och interagerar med substratet 2,3. Ibland är E4-enzymer (Ubiquitin-kedjeförlängningsfaktorer) nödvändiga för att främja multiubiquitinkedjemontering3.
Ubiquitin har sju lysinrester (K6, K11, K27, K29, K33, K48 och K63), vilket möjliggör bildandet av polyubiquitinkedjor som genererar distinkta kopplingar för att producera olika tridimensionella strukturer som kommer att erkännas av flera effektorproteiner 4,5. Därför är den typ av polyubiquitinkedja som införs i substratet avgörande för att bestämma dess cellöde 6,7,8. Dessutom kan substratet också allestädes närvarande genom dess N-terminala rester som kallas N-degroner. Specifika E3-ubiquitin-ligaser är ansvariga för N-degronigenkänning, vilket möjliggör polyubiquitylation av närliggande lysinrester9.
Numera finns det mer än 40 olika SCF-specifika substrat som karakteriseras. Bland dessa kan viktiga regulatorer av flera biologiska vägar, inklusive celldifferentiering och utveckling samt cellöverlevnad och död, hittas 10,11,12,13. Således är identifieringen av specifika substrat för varje E3-ubiquitin-ligas avgörande för att utforma en omfattande karta över olika biologiska händelser. Även om identifieringen av sanna substrat är biokemiskt utmanande, är användningen av biokemibaserade metoder mycket lämplig för att utvärdera kedjespecificitet och skillnaden mellan mono- och polyubiquitylation14. Denna studie beskriver ett komplett protokoll för ubiquitylationsanalys med hjälp av däggdjurscellinjen HEK293T som överuttrycker substratet UXT-V2 (allestädes närvarande uttryckt prefoldinliknande chaperonisoform 2) med E3-ubiquitin-ligaskomplexet SCF (Fbxo7). UXT-V2 är en viktig co-faktor för NF-κB-signalering, och när detta protein slås ner i celler hämmar det TNF-α-inducerad NF-κB-aktivering11. För att detektera polyubiquitylerad UXT-V2 används proteasomhämmaren MG132 eftersom den har förmågan att blockera den proteolytiska aktiviteten hos 26S-underenheten i proteasomkomplexet15. Vidare skickas cellextraktet till en småskalig IP för att rena substratet, med användning av en specifik antikropp immobiliserad till agarosharts för efterföljande detektion av WB med användning av utvalda antikroppar. Detta protokoll är mycket användbart för att validera substrat ubiquitylation i den cellulära miljön, och det kan också anpassas för olika typer av däggdjursceller och andra E3 ubiquitin-ligaskomplex. Det är emellertid nödvändigt att validera substratet som testats genom en in vitro-ubiquitylationsanalys också, eftersom båda protokollen kompletterar varandra när det gäller identifiering av sanna substrat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ubiquitylation är en viktig post-translationell modifiering som reglerar nivåerna av flera proteiner och spelar en avgörande roll i många signalvägar och biologiska processer, vilket säkerställer en hälsosam intracellulär miljö. Ubiquitin-proteasomsystemet (UPS) är ett av huvudfokuserna för den senaste farmaceutiska forskningen, vilket ger möjlighet att stabilisera tumörsuppressorer eller inducera nedbrytningen av onkogena produkter22. Till exempel främjar den avvikande spridningen …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
F.R.T stöds av FAPESP-bidragsnummer 2020/15771-6 och CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P och V.S stöds av CAPES. C.R.S.T.B.C stöddes av FAPESP-stipendienummer 2019/23466-1. Vi tackar Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) för det materiella stödet.
Materials
| 1.5 mL microtube | Axygen | PMI110-06A | |
| 100 mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL tube | Corning | 430766 | |
| 96-well plate | Cralplast | 655111 | |
| Agarose-anti-HA beads | Sigma-Aldrich | E6779 | |
| Anti Mouse antibody | Seracare | 5220-0341 | Goat anti-Mouse IgG |
| Anti Rabbit antibody | Seracare | 5220-0337 | Goat anti-Rabbit IgG |
| Anti-Actin antibody | Sigma-Aldrich | A3853 | Dilution used: 1:2000 |
| Anti-Fbxo7 antibody | Sigma-Aldrich | SAB1407251 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H3663 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-Myc antibody | Cell Signalling | 2272 | Dilution used: 1:1000 |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-100G | Bovine Serum Albumin |
| Cell incubator | Nuaire | NU-4850 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | 500 x g for 5 min |
| ChemiDoc | BioRad | ||
| Digital pH meter | Kasvi | K39-2014B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | 10-017-CRV | High glucose |
| Fetal bovine serum | Gibco | F4135 | Filtrate prior use |
| HA peptide | Sigma-Aldrich | I2149 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| KCl | VWR Life Science | 0365-500G | |
| Kline rotator | Global Trade Technology | GT-2OIBD | |
| MG-132 | Boston Biochem | I-130 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418R | |
| Na3VO4 (Ortovanadato) | |||
| NaF | |||
| Nitrocellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600016 | |
| NP40 (IGEPAL CA-630) | Sigma-Aldrich | I8896-100ML | |
| Optical microscope | OPTIKA microscopes | SN510768 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | V79020 | For mammalian expression |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367 | |
| pcDNA3-UXTV2-HA | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI | |
| Pen Strep Glutamine 100x | Gibco | 10378-016 | |
| Phosphate buffered saline 10x | AccuGENE | 51226 | To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| Ponceau S | VWR Life Science | 0860-50G | |
| Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Rocking Shaker | Kasvi | 19010005 | |
| SDS-PAGE system | BioRad | 165-8004 | |
| Solution Homogenizer | Phoenix Luferco | AP-22 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| Trypsine (TrypLe Express) | Gibco | 12605-028 | |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 |
Referências
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Callis, J. The ubiquitination machinery of the ubiquitin system. The Arabidopsis Book. 12, 0174 (2014).
- Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
- French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7 (1), 6 (2021).
- Komander, D., et al. Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143 (5), 682-685 (2010).
- Davies, B. A., et al. Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).
- Raasi, S., Wolf, D. H. Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome. Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).
- Pan, M., et al. Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination. Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).
- Raducu, M., et al. SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development. The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).
- Spagnol, V., et al. The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1865 (1), 129754 (2021).
- Teixeira, F. R., et al. Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson’s disease. Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).
- Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover. Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).
- van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M. Visualizing ubiquitination in mammalian cells. EMBO Reports. 20 (2), 1-18 (2019).
- Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates. Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).
- Bradford, M. A. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 228, 726-734 (1970).
- Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -. H., Nothwang, H. G. Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue. Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).
- Huang, Y., et al. UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria. The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).
- Huang, Y., et al. UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).
- Sun, S., et al. UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome. The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).
- Huang, X., Dixit, V. M. Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development. Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).
- Rajkumar, S. V. Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).
- Hideshima, T., et al. The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells. Pesquisa do Câncer. 61 (7), 3071-3076 (2001).
- Tietsche, V., et al. New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Kuiken, H. J., et al. Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).
- Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
- Iconomou, M., Saunders, D. N. Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates. Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).
- Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER. Cell. 154 (3), 609-622 (2013).
- Hunter, T. The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).
