अधिवृक्क क्रोमाफिन कोशिकाओं में संलयन छिद्र गतिशीलता के तीन तरीकों को मापने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी
Summary
यह प्रोटोकॉल गोजातीय अधिवृक्क क्रोमाफिन कोशिकाओं में तीन संलयन मोड का पता लगाने के लिए एक कॉन्फोकल इमेजिंग तकनीक का वर्णन करता है। इन संलयन मोड में 1) क्लोज-फ्यूजन (जिसे चुंबन-और-रन भी कहा जाता है), जिसमें संलयन छिद्र खोलना और बंद करना शामिल है, 2) स्टे-फ्यूजन, जिसमें संलयन छिद्र खोलना और खुले छिद्र को बनाए रखना शामिल है, और 3) हटना-संलयन, जिसमें फ्यूज्ड पुटिका संकोचन शामिल है।
Abstract
गतिशील संलयन छिद्र खोलने और बंद करने से एक्सोसाइटोसिस और एंडोसाइटोसिस की मध्यस्थता होती है और उनके कैनेटीक्स का निर्धारण होता है। यहां, यह विस्तार से प्रदर्शित किया गया है कि प्राथमिक संस्कृति गोजातीय अधिवृक्क क्रोमाफिन कोशिकाओं में तीन संलयन मोड का पता लगाने के लिए पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के साथ संयोजन में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कैसे किया गया था। तीन संलयन मोड में 1) क्लोज-फ्यूजन (जिसे चुंबन-और-रन भी कहा जाता है), जिसमें संलयन छिद्र खोलना और बंद करना शामिल है, 2) स्टे-फ्यूजन, जिसमें संलयन छिद्र खोलना और खुले छिद्र को बनाए रखना शामिल है, और 3) हटना-संलयन, संलयन-जनित Ω-आकार प्रोफ़ाइल का संकोचन शामिल है जब तक कि यह प्लाज्मा झिल्ली पर पूरी तरह से विलीन न हो जाए।
इन संलयन मोड का पता लगाने के लिए, प्लाज्मा झिल्ली को फॉस्फोलिपेज सी δ (पीएच-एमएनजी) के पीएच डोमेन से जुड़े एमएनग्रीन को ओवरएक्सप्रेस करके लेबल किया गया था, जो प्लाज्मा झिल्ली के साइटोसोल-फेसिंग पत्रक पर फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल -4,5-बिसफॉस्फेट (पीटीडीआईएन (4,5) पी2) को बांधता है; पुटिकाओं को फ्लोरोसेंट झूठी न्यूरोट्रांसमीटर एफएफएन 511 के साथ लोड किया गया था ताकि पुटिका सामग्री रिलीज का पता लगाया जा सके; और संलयन छिद्र बंद होने का पता लगाने के लिए एटो 655 को स्नान समाधान में शामिल किया गया था। इन तीन फ्लोरोसेंट जांच को संलयन छिद्र खोलने, सामग्री रिलीज, संलयन छिद्र बंद करने और पुटिका आकार परिवर्तनों को फ्यूज करने का पता लगाने के लिए लाइव क्रोमाफिन कोशिकाओं में ~ 20-90 एमएस प्रति फ्रेम पर एक साथ चित्रित किया गया था। विश्लेषण विधि को इन प्रतिदीप्ति मापों से तीन संलयन मोड को अलग करने के लिए वर्णित किया गया है। यहां वर्णित विधि, सिद्धांत रूप में, क्रोमाफिन कोशिकाओं से परे कई स्रावी कोशिकाओं पर लागू हो सकती है।
Introduction
झिल्ली संलयन कई जैविक कार्यों की मध्यस्थता करता है, जिसमें अन्तर्ग्रथनी संचरण, रक्त ग्लूकोज होमियोस्टेसिस, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और वायरल प्रविष्टि 1,2,3 शामिल हैं। एक्सोसाइटोसिस, जिसमें प्लाज्मा झिल्ली में पुटिका संलयन शामिल है, न्यूरोनल नेटवर्क गतिविधियों जैसे कई महत्वपूर्ण कार्यों को प्राप्त करने के लिए न्यूरोट्रांसमीटर और हार्मोन जारी करता है। फ्यूजन पुटिका सामग्री को जारी करने के लिए एक छिद्र खोलता है, जिसके बाद छिद्र फ्यूजिंग पुटिका को पुनः प्राप्त करने के लिए बंद हो सकता है, जिसे चुंबन-एंड-रन 1,4 कहा जाता है। दोनों अपरिवर्तनीय और प्रतिवर्ती संलयन छिद्र खोलने को एकल पुटिका संलयन के संलयन छिद्र चालकता रिकॉर्डिंग के साथ संयुक्त सेल-संलग्न समाई रिकॉर्डिंग के साथ मापा जा सकता है।
इसे अक्सर पूर्ण-पतन संलयन को प्रतिबिंबित करने के रूप में व्याख्या की जाती है, जिसमें फ्यूजिंग पुटिका के चपटा होने तक संलयन का फैलाव शामिल होता है, और चुंबन-और-रन, जिसमें संलयन छिद्र खोलने और बंद करना शामिल होता है, क्रमशः 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . क्रोमाफिन कोशिकाओं में हालिया कंफोकल और उत्तेजित उत्सर्जन की कमी (एसटीईडी) इमेजिंग अध्ययनों ने सीधे संलयन छिद्र खोलने और बंद करने (चुंबन-और-रन, जिसे क्लोज-फ्यूजन भी कहा जाता है), संलयन छिद्र खोलने का अवलोकन किया जो लंबे समय तक खुले छिद्र के साथ Ω-आकार बनाए रखता है, जिसे स्टे-फ्यूजन कहा जाता है, और फ्यूजिंग पुटिका का सिकुड़ना जब तक कि यह प्लाज्मा झिल्ली के साथ पूर्ण विलीन नहीं हो जाता, जो विलय के लिए पूर्ण पतन संलयन की जगह लेताहै 8,14,15,16,17.
न्यूरॉन्स में, संलयन छिद्र खोलने और बंद होने का पता इमेजिंग के साथ लगाया गया है जो पुटिकाओं में प्रीलोडेड क्वांटम डॉट्स की रिहाई दिखा रहा है जो संलयन छिद्र से बड़े हैं और तंत्रिका टर्मिनलों 5,18,19 के रिलीज चेहरे पर संलयन छिद्र चालकता माप के साथ। अधिवृक्क क्रोमाफिन कोशिकाओं का व्यापक रूप से एक्सो- और एंडोसाइटोसिस20,21 के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। यद्यपि क्रोमाफिन कोशिकाओं में बड़े घने-कोर पुटिकाएं होती हैं, जबकि सिनैप्स में छोटे सिनैप्टिक पुटिकाएं होती हैं, क्रोमाफिन कोशिकाओं और सिनैप्स में एक्सोसाइटोसिस और एंडोसाइटोसिस प्रोटीन काफी अनुरूप होते हैं 10,11,12,20,21,22,23.
यहां, गोजातीय अधिवृक्क क्रोमाफिन कोशिकाओं (चित्रा 1) में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के साथ संयुक्त एक कॉन्फोकल इमेजिंग विधि का उपयोग करके इन तीन संलयन मोड को मापने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। इस विधि में एक्सोसाइटोसिस का पता लगाने के लिए पुटिकाओं में फ्लोरोसेंट झूठे न्यूरोट्रांसमीटर (एफएफएन 511) की लोडिंग शामिल है; संलयन-जनित Ω-आकार प्रोफ़ाइल को भरने के लिए स्नान समाधान में एटो 655 (ए 655) के अलावा, और फॉस्फोलिपेज़ सी δ (पीएच) के पीएच डोमेन के साथ प्लाज्मा झिल्ली की लेबलिंग, जो प्लाज्मा झिल्ली8,15,24 पर पीटीडीआईएन (4,5) पी 2 को बांधती है। विभिन्न फ्लोरोसेंट तीव्रता में परिवर्तन के माध्यम से संलयन छिद्र गतिशीलता का पता लगाया जा सकता है। यद्यपि क्रोमाफिन कोशिकाओं के लिए वर्णित है, यहां वर्णित इस पद्धति के सिद्धांत को क्रोमाफिन कोशिकाओं से परे कई स्रावी कोशिकाओं पर व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
संलयन छिद्र और ट्रांसमीटर रिलीज की गतिशीलता का पता लगाने के लिए एक कंफोकल माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग विधि का वर्णन किया गया है, साथ ही गोजातीय अधिवृक्क क्रोमाफिन कोशिकाओं4,24 में तीन …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस काम का समर्थन करने के लिए एनआईएनडीएस इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम (जेडआईए एनएस 003009-13 और जेडआईए एनएस 003105-08) को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 1.1214E+10 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
Referências
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