부신 크로마핀 세포에서 융합 기공 역학의 세 가지 모드를 측정하는 공초점 현미경 검사
Summary
이 프로토콜은 소 부신 크로마핀 세포에서 세 가지 융합 모드를 검출하기 위한 공초점 이미징 기술을 기술한다. 이러한 융합 모드에는 1) 융합 기공 개폐 및 폐쇄를 포함하는 근접 융합 (키스 앤 런이라고도 함), 2) 융합 기공 개방 및 개방 된 기공 유지를 포함하는 체류 융합, 3) 융합 된 소낭 수축을 포함하는 수축 융합이 포함됩니다.
Abstract
동적 융합 공극 개방 및 폐쇄는 엑소사이토시스 및 엔도사이토시스를 매개하고 이들의 동역학을 결정한다. 여기에서, 공초점 현미경이 일차 배양 소 부신 크로마핀 세포에서 세 가지 융합 모드를 검출하기 위해 패치-클램프 기록과 함께 어떻게 사용되었는지를 상세히 입증한다. 세 가지 융합 모드에는 1) 융합 기공 개폐 및 폐쇄를 포함하는 근접 융합 (키스 앤 런이라고도 함), 2) 융합 기공 개방 및 개방 된 기공 유지를 포함하는 체류 융합, 3) 원형질막에서 완전히 병합 될 때까지 융합 생성 된 Ω 형상 프로파일의 수축을 포함하는 수축 융합이 포함됩니다.
이들 융합 모드를 검출하기 위해, 원형질막은 포스포리파제 C δ(PH-mNG)의 PH 도메인과 부착된 mNeonGreen을 과발현시킴으로써 표지하였고, 이는 원형질막의 시토졸 대향 전단지에서 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트(PtdIns(4,5)P2)에 결합하고; 수포 함량 방출을 검출하기 위해 형광 거짓 신경전달물질 FFN511로 로딩된 소포; 및 Atto 655를 융합 기공 폐쇄를 검출하기 위해 욕조 용액에 포함시켰다. 이 세 개의 형광 프로브를 라이브 크로마핀 세포에서 프레임당 ~20-90ms로 동시에 이미징하여 융합 기공 개방, 함량 방출, 융합 기공 폐쇄 및 융합 소포 크기 변화를 검출하였다. 분석 방법은 이러한 형광 측정으로부터 세 가지 융합 모드를 구별하기 위해 설명된다. 여기에 기술된 방법은 원칙적으로 크로마핀 세포를 넘어 많은 분비 세포에 적용할 수 있다.
Introduction
막 융합은 시냅스 전달, 혈당 항상성, 면역 반응 및 바이러스 진입 1,2,3을 포함한 많은 생물학적 기능을 매개합니다. 원형질막에서 소낭 융합을 포함하는 외세포증은 신경 전달 물질과 호르몬을 방출하여 신경 네트워크 활동과 같은 많은 중요한 기능을 수행합니다. 퓨전은 수포 내용물을 방출하기 위해 기공을 열고, 그 후에 기공은 키스 앤 런 1,4라고 불리는 융합 소포를 회수하기 위해 닫힐 수 있습니다. 비가역적 및 가역적 융합 기공 개방 둘 모두는 단일 소포 융합의 융합 공극 전도도 기록과 결합된 셀 부착 커패시턴스 기록으로 측정될 수 있다.
이것은 종종 융합 소포의 평탄화까지 융합의 팽창을 포함하는 완전 붕괴 융합을 반영하는 것으로 해석되며, 융합 기공 개폐를 포함하는 키스 앤 런은 각각 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . 최근 크로마핀 세포에서의 공초점 및 자극 방출 고갈(STED) 영상 연구는 융합 기공 개폐(키스 앤 런(kiss-and-run, close-fusion이라고도 함), 오랜 시간 동안 열린 기공으로 Ω 형태를 유지하는 융합 기공 개구, 체류-융합(stay-fusion)이라 불리우며, 융합된 소포가 원형질막과 완전히 병합될 때까지 융합된 소포의 축소를 직접 관찰하였으며, 이는 원형질막과 융합된 소포를 병합하기 위한 완전 붕괴 융합을 대체한다4, 8,14,15,16,17.
뉴런에서, 융합 기공 개폐는 융합 기공보다 큰 소포에 미리 로딩된 양자점의 방출을 보여주는 이미징과 신경 말단의 방출면에서의 융합 기공 전도도 측정(5,18,19)으로 검출되었다. 부신 크로마핀 세포는 exo- 및 엔도사이토시스20,21의 연구를 위한 모델로서 널리 사용된다. 크로마핀 세포에는 큰 조밀 코어 소포가 포함되어 있지만 시냅스에는 작은 시냅스 소포가 포함되어 있지만 크로마핀 세포와 시냅스의 엑소 사이토시스 및 엔도 사이토시스 단백질은 10,11,12,20,21,22,23과 매우 유사합니다.
여기에서, 소 부신 크로마핀 세포에서 전기생리학과 결합된 공초점 이미징 방법을 이용하여 이들 세 가지 융합 모드를 측정하는 방법이 설명된다(도 1). 이 방법은 형광 거짓 신경 전달 물질 (FFN511)을 소포에 로딩하여 외세포증을 검출하는 것을 포함합니다. 합착 용액에 Atto 655(A655)를 첨가하여 융해-생성된 Ω형 프로파일을 채우고, 원형질막 8,15,24에서 PtdIns(4,5)P2에 결합하는 포스포리파제 C δ(PH)의 PH 도메인으로 원형질막의 표지를 채운다. 융합 기공 역학은 상이한 형광 강도의 변화를 통해 검출될 수 있다. 크로마핀 세포에 대해 기술되었지만, 여기에 기술된 이 방법의 원리는 크로마핀 세포를 훨씬 넘어서는 많은 분비 세포에 널리 적용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
공초점 현미경 이미징 방법은 융합 기공 및 송신기 방출의 역학뿐만 아니라 소 부신 크로마핀 세포4,24에서 세 가지 융합 모드, 근접 융합, 체류 융합 및 수축 융합을 검출하기 위해 설명됩니다. 세포를 탈분극시키고 이에 의해 엑소사이토시스 및 엔도사이토시스를 불러일으키는 전기생리학적 방법이 기재되어 있다. 체계적인 공초점 이미지 처리는 융합…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업을 지원해 주신 NINDS 교내 연구 프로그램(ZIA NS003009-13 및 ZIA NS003105-08)에 감사드립니다.
Materials
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 1.1214E+10 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
Referências
- Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
- Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).
- Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
- Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356 (2014).
- Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
- Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
- Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503 (2021).
- Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
- Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
- Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604 (2016).
- Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
- Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
- Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
- Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).
- Bornstein, S. R., et al. Chromaffin cells: the peripheral brain. Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).
- Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
- Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).
- Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
- O’Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).
- Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
- Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
- Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
- Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).
- Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).
