Konfokal mikroskopi for å måle tre moduser av Fusion Pore Dynamics i binyrene chromaffin celler
Summary
Denne protokollen beskriver en konfokal bildeteknikk for å oppdage tre fusjonsmoduser i bovin binyre binyrene. Disse fusjonsmodusene inkluderer 1) tett fusjon (også kalt kyss-og-løp), som involverer fusjonsporeråpning og -lukking, 2) stay-fusion, som involverer fusjonsporering og vedlikehold av den åpne poren, og 3) krympefusjon, som involverer smeltet vesiclekrymping.
Abstract
Dynamisk fusjon pore åpning og lukking mediat exocytosis og endokytose og bestemme deres kinetikk. Her er det demonstrert i detalj hvordan konfokal mikroskopi ble brukt i kombinasjon med patch-clamp opptak for å oppdage tre fusjonsmoduser i primærkultur bovin binyre binyrene celler. De tre fusjonsmodusene inkluderer 1) nærfusjon (også kalt kyss-og-løp), som involverer fusjonsporåpning og -lukking, 2) stay-fusion, som involverer fusjonsporåpning og vedlikehold av den åpne poren, og 3) krympefusjon, som involverer krymping av den fusjonsgenererte Ω-formprofilen til den smelter helt sammen ved plasmamembranen.
For å oppdage disse fusjonsmodusene ble plasmamembranen merket med overekspresserende mNeonGreen festet med PH-domenet til fosfolipase C δ (PH-mNG), som binder seg til fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat (PtdIns(4,5)P2) ved det cytosolvendte pakningsvedlegget i plasmamembranen; vesicles ble lastet med fluorescerende falsk nevrotransmitter FFN511 for å oppdage vesikulær innholdsutgivelse; og Atto 655 ble inkludert i badeløsningen for å oppdage fusjonsporedlegging. Disse tre fluorescerende sondene ble avbildet samtidig ved ~ 20-90 ms per ramme i levende kromatinceller for å oppdage fusjonsporåpning, innholdsutgivelse, fusjonsporerende og fusjonerende vesiclestørrelsesendringer. Analysemetoden er beskrevet for å skille tre fusjonsmoduser fra disse fluorescensmålingene. Metoden beskrevet her kan i prinsippet gjelde for mange sekretoriske celler utover kromoffinceller.
Introduction
Membranfusjon formidler mange biologiske funksjoner, inkludert synaptisk overføring, blodsukker homeostase, immunrespons og viral oppføring 1,2,3. Exocytose, som involverer vesiclefusjon ved plasmamembranen, frigjør nevrotransmittere og hormoner for å oppnå mange viktige funksjoner, for eksempel nevronale nettverksaktiviteter. Fusion åpner en pore for å frigjøre vesikulært innhold, hvorpå poren kan lukke seg for å hente den fusing vesicle, som kalles kyss-og-kjør 1,4. Både irreversibel og reversibel fusjonsporåpning kan måles med celletilknyttede kapasitansopptak kombinert med fusjons poreledningsopptak av enkelt vesiclefusjon.
Dette tolkes ofte som reflekterende full-kollaps fusjon, som involverer utvidelse av fusjonen til sammenslåing av fusjon vesicle, og kyss-og-løp, involverer fusjon pore åpning og lukking, henholdsvis 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Nylige konfokale og stimulerte utslippsuttømmingsstudier (STED) i kromboffinceller observerte direkte fusjonsporåpning og -lukking (kyss-og-løp, også kalt nærfusjon), fusjonsporåpning som opprettholder en Ω-form med en åpen pore i lang tid, betegnet stay-fusion og krymping av fusing vesicle til den komplette fusjonerer med plasmamembranen, som erstatter full-kollaps fusjon for sammenslåing av fusing vesiles med plasmamembranen4, 8,14,15,16,17.
I nevroner har fusjonsporåpning og -lukking blitt oppdaget med avbildning som viser frigjøring av kvanteprikker forhåndslastet i vesikler som er større enn fusjonsporene og med fusjonsporiske ledningsmålinger ved frigjøringsflaten til nerveterminaler 5,18,19. Binyrenes kromoffinceller er mye brukt som modell for studiet av ekso- og endokytose 20,21. Selv om kromoffinceller inneholder store tette vesicles, mens synapser inneholder små synaptiske vesicles, er eksocytose- og endokytoseproteinene i kromboffinceller og synapser ganske analoge 10,11,12,20,21,22,23.
Her beskrives en metode for å måle disse tre fusjonsmodusene ved hjelp av en konfokal avbildningsmetode kombinert med elektrofysiologi i bovin binyrenes kromoffinceller (figur 1). Denne metoden innebærer lasting av fluorescerende falske nevrotransmittere (FFN511) i vesikler for å oppdage eksocytose; tilsetning av Atto 655 (A655) i badeløsningen for å fylle den fusjonsgenererte Ω-formprofilen, og merking av plasmamembranen med PH-domenet til fosfolipase C δ (PH), som binder seg til PtdIns (4,5)P2 ved plasmamembranen 8,15,24. Fusion poredynamikk kan oppdages gjennom endringer i forskjellige fluorescerende intensiteter. Selv om det er beskrevet for kromboffinceller, kan prinsippet om denne metoden beskrevet her brukes mye på mange sekretoriske celler langt utover kromoffinceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
En konfokal mikroskopisk bildemetode er beskrevet for å oppdage dynamikken i fusjonspor og senderutløsning, samt tre fusjonsmoduser, tett fusjon, stay-fusion og krympefusjon i bovin binyre binyrenes kromatinceller 4,24. En elektrofysiologisk metode for å depolarisere cellen og dermed fremkalle ekso- og endokytose er beskrevet. Systematisk konfokal bildebehandling gir informasjon om ulike typer poreoppførsel for fusjons- og fisjonshendelser.
<p class="jove…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker NINDS Intramural Research Programs (ZIA NS003009-13 og ZIA NS003105-08) for å støtte dette arbeidet.
Materials
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 1.1214E+10 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
Referências
- Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
- Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).
- Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
- Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356 (2014).
- Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
- Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
- Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503 (2021).
- Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
- Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
- Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604 (2016).
- Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
- Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
- Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
- Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).
- Bornstein, S. R., et al. Chromaffin cells: the peripheral brain. Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).
- Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
- Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).
- Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
- O’Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).
- Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
- Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
- Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
- Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).
- Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).
